详情

原文传递一种检测血液中7-酮基胆固醇含量的方法

专利名称：	一种检测血液中7-酮基胆固醇含量的方法
摘要：	本发明提供了一种检测血液中7‑酮基胆固醇含量的方法，该方法包括：利用高效液相串联质谱仪分别检测至少三个标准溶液，得到各个标准溶液的色谱图，该标准溶液含浓度已知的7‑酮基胆固醇和内标物；根据得到的标准溶液的色谱图，拟合得到标准曲线方程；处理待检测血液得到血液样品，并加入浓度已知的内标物，经样品前处理以得到待测样品；在相同检测条件下检测待测样品得到色谱图；根据待测样品的色谱图和标准曲线方程，得到待检测血液中7‑酮基胆固醇的含量。因此，本方案能够检测血液中7‑酮基胆固醇的含量。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	北京;11
申请人：	北京和合医学诊断技术股份有限公司
发明人：	杨缓缓;解娜;贾永娟;倪君君
专利状态：	有效
申请日期：	2019-09-05T00:00:00+0800
发布日期：	2019-11-05T00:00:00+0800
申请号：	CN201910837951.7
公开号：	CN110412177A
代理机构：	济南信达专利事务所有限公司
代理人：	程佩玉
分类号：	G01N30/02(2006.01);G;G01;G01N;G01N30
申请人地址：	101111 北京市北京经济技术开发区经海六路5号院14号楼1层、2层、3层、5层、6层、7层
主权项：	1.一种检测血液中7-酮基胆固醇含量的方法，其特征在于，包括：利用高效液相串联质谱仪，在一定检测条件下，分别检测至少三个标准溶液，得到各个标准溶液的色谱图，其中，任一标准溶液中均含有浓度已知的7-酮基胆固醇和浓度已知的内标物，不同标准溶液中7-酮基胆固醇的浓度不同；根据得到的各个标准溶液的色谱图，拟合得到标准曲线方程；处理待检测血液得到血液样品；将一定量的含有浓度已知的内标物的内标工作液，添加到所述血液样品中，并进行样品前处理以得到待测样品；利用高效液相串联质谱仪，在相同检测条件下，检测所述待测样品，得到所述待测样品的色谱图；根据所述待测样品的色谱图和所述标准曲线方程，得到所述待检测血液中7-酮基胆固醇的含量。 2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述检测条件中的液相条件包括：色谱柱的长度为50mm、内径为2.1mm、填料粒径为2.6μm，流动相为含体积比为0.1％-0.5％甲酸的水和含体积比为0.1％-0.5％甲酸的甲醇，分析时间为4.5min，柱温为20℃-40℃，进样量为0.1μL-30μL，流速为0.40mL/min-0.60mL/min。 3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述液相条件还包括：Phenomenex公司的Kinetex C18色谱柱；和/或，所述液相条件还包括：洗脱过程为：含体积比为0.3％甲酸的水和含体积比为0.3％甲酸的甲醇的百分用量比，在2.41min-3.50min的洗脱时间范围内为0：100，在其他洗脱时间范围内为15:85。 4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述检测条件中的串联质谱条件包括：采用大气压化学电离源ESI，正离子扫描模式，选择反应监测模式，鞘气流速为10L/min，鞘气温度为300℃，加热气流速为12L/min，加热气温度为250℃，雾化电压为40psi，毛细管电压4500psi。 5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述将一定量的含有浓度已知的内标物的内标工作液，添加到所述血液样品中，并进行样品前处理以得到待测样品，包括：用移液枪移取一定量的含有浓度已知的内标物的内标工作液，置于离心管中，再加入50μL-300μL所述血液样品，再加入一定量的沉淀蛋白试剂，在1500rpm-2500rpm的转速下涡旋混合2min-5min；涡旋混合后在离心管中加入一定量的萃取试剂，在1500rpm-2500rpm的转速下涡旋混合5min-15min，再在10000rpm-15000rpm的转速下高速离心8min-15min；移取一定量离心后的上清液至离心管中，并转移至氮气吹干装置上以将上清液吹干；移取一定量的复溶液至上清液吹干的离心管中，在1500rpm-2500rpm的转速下涡旋混合1min-3min，再在10000rpm-15000rpm的转速下高速离心4min-6min，得到待测样品。 6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述内标工作液的移取量为10μL；和/或，所述沉淀蛋白试剂为甲醇，甲醇的用量为100μL-300μL；和/或，所述萃取试剂为正己烷，正己烷的用量为800μL-1200μL；和/或，所述复溶液为含体积比为70％-100％甲醇和体积比为0.1％-0.5％甲酸的水，所述复溶液的用量为50μL-200μL。 7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述处理待检测血液得到血液样品，包括：取不少于2mL的待检测血液，在3500rpm的转速下离心10min，取上清液以作为血液样品；所述血液样品的保存条件为，置于-20℃下保存直至分析前备用。 8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述分别检测至少三个标准溶液之前，进一步包括：利用移液器移取10μL标准工作液、10μL所述内标工作液和80μL稀释液至离心管中，其中，所述稀释液中甲醇和水的比例为85:15，所述标准工作液中含有浓度已知的7-酮基胆固醇；将该离心管在1500rpm-2500rpm的转速下涡旋混匀1min-2min后，移取上清液以得到标准溶液。 9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，在所述得到标准溶液之前，进一步包括：精确称取10mg的7-酮基胆固醇的标准品，并置于10mL容量瓶中，用甲醇进行溶解并定容，以得到标准储备液，并在-80℃下保存，有效期为6个月；取一定量的所述标准储备液置于一定体积的容量瓶中，用70％-100％的甲醇水溶液进行稀释并定容，以得到所述标准工作液，且所述标准工作液中7-酮基胆固醇的浓度介于20ng/mL-1000ng/mL之间，并在-80℃下保存，有效期为3个月；取1mg的内标物的标准品，该内标物为7-酮基胆固醇的同位素内标物，并置于10mL容量瓶，用甲醇进行溶解并定容，以得到内标储备液，并在-80℃下保存，有效期为1年；取一定量的所述内标储备液置于一定体积的容量瓶中，用85％的甲醇水溶液进行稀释并定容，以得到所述内标工作液，并在-80℃下保存，有效期为1年。 10.根据权利要求1至9中任一所述的方法，其特征在于，内标物为7-酮基胆固醇的同位素内标物；和/或，所述至少三个标准溶液中7-酮基胆固醇的浓度包括：20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL中的至少三个。
所属类别：	发明专利