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原文传递一种血清中梅毒螺旋体抗体的快速检测方法及其应用

专利名称：	一种血清中梅毒螺旋体抗体的快速检测方法及其应用
摘要：	本发明公开了一种血清中梅毒螺旋体抗体的快速检测方法及其应用，该方法通过使用修饰了protein A和protein G的树脂颗粒捕获血清中的抗体，利用融合了荧光素酶的梅毒脂蛋白TP15、TP17和TP47与捕获在树脂上的抗体结合，再通过检测融合的热稳定荧光素酶的发光活性，实现血清中梅毒螺旋体抗体的灵敏快速检测。该方法使用的荧光素酶与梅毒脂蛋白融合蛋白，能特异地结合梅毒螺旋体的抗体，而且其中的荧光素酶是热稳定性好的荧光素酶。该融合蛋白应用于本发明的快速检测方法，方法使用的血清样本量少，仅需1μL血清就能在20分钟内实现血清中梅毒螺旋体抗体的检测，能准确区分抗体的阴阳性，与传统的ELISA有着相似的灵敏度。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	湖北;42
申请人：	中国科学院武汉病毒研究所
发明人：	危宏平;余军平;李俊花
专利状态：	有效
申请日期：	2019-08-22T00:00:00+0800
发布日期：	2019-11-15T00:00:00+0800
申请号：	CN201910778256.8
公开号：	CN110456052A
代理机构：	上海精晟知识产权代理有限公司
代理人：	安曼
分类号：	G01N33/571(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	430000湖北省武汉市武昌区水果湖街小洪山中区44号
主权项：	1.一种血清中梅毒螺旋体抗体的快速检测方法及其应用，其特征在于：包括采用protein A/G的树脂，以及稳定型荧光素酶的梅毒螺旋体抗原TP15-Luc146、TP17-Luc146、TP47-Luc146。 2.一种血清中梅毒螺旋体抗体的快速检测方法，其特征在于：具体包括以下步骤： S1、将proteinA/G-树脂颗粒涡旋混匀，取100μL于1.5mL EP管中，加入200μL缓冲液I，混匀后2500g离心1min，弃上清，重复洗三次，最后将颗粒悬于200μL缓冲液I； S2、取10μL步骤S1的树脂颗粒于200μL PCR管，加入1μL血清样本及相应的阴性和阳性对照，9μL缓冲液I，再加入250μg/mL TP15/TP17/TP47-Luc146各10μL，混匀后置于孵育器中，然后在28℃，300rpm孵育15min； S3、加入200μLPBST洗步骤S2中的树脂，弃上清，重复三次，再加入100μL缓冲液II； S4、将10μL 5mM D-荧光素、10μL 1μMATP和80μL缓冲液II配成混合液加入到手持式发光检测仪的专门反应管中； S5、将步骤S3中的100μL树脂悬液加到步骤S4的反应管中，轻轻混匀，迅速置入手持式发光检测仪中读数； S6、进行结果分析：S/B值大于2时，说明血清中存在TP的抗体，小于2时，说明血清中无TP抗体。 3.根据权利要求2所述的一种血清中梅毒螺旋体抗体的快速检测方法，其特征在于：所述步骤1中的缓冲液I为：25mM Tris-HCl和150mM NaCl的混合溶液，且缓冲液I的pH为7.2。 4.根据权利要求2所述的一种血清中梅毒螺旋体抗体的快速检测方法，其特征在于：所述缓冲液II为：50mM Tris-HCl缓冲和10mM MgCl2的混合溶液，且缓冲液II的pH为7.4。 5.根据权利要求2所述的一种血清中梅毒螺旋体抗体的快速检测方法，其特征在于：所述步骤S1检测试剂中所使用ProteinA/G树脂的体积为10μL，且检测的反应体系为：10μLProteinA/G，血清样本1μL加9μL缓冲液I，TP15/TP17/TP47-Luc146各10μL。 6.根据权利要求2所述的一种血清中梅毒螺旋体抗体的快速检测方法，其特征在于：所述步骤S2的检测方法中树脂、血清样本和TP15/TP17/TP47-Luc146混合后的孵育条件为：28℃，300rpm，孵育15min。 7.根据权利要求2所述的一种血清中梅毒螺旋体抗体的快速检测方法，其特征在于：所述步骤S2的检测方法中，所使用的TP15/TP17/TP47-Luc146的浓度为250μg/mL。 8.一种基于梅毒螺旋体抗原TP15，TP17，TP47与热稳定型Luc146开发的一种血清中梅毒螺旋体抗体的快速检测试剂盒，其特征在于：所述检测方法中采用的Luc146为热稳定的荧光素酶，所述荧光素酶的序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。 9.根据权利要求8所述的一种热稳定性的荧光素酶，其特征在于：所述荧光素酶的反应体系为：100μL固定了荧光素酶Luc146的树脂、10μL 5mM D-荧光素、10μL 1μMATP以及80μL的缓冲液II。 10.根据权利要求8所述的一种热稳定性的荧光素酶，其特征在于：所述的荧光素酶能在60℃稳定60min以上。
所属类别：	发明专利