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原文传递一种基于马来酰亚胺功能的琼脂糖凝胶基蛋白微阵列免疫传感器的制备方法及应用

专利名称：	一种基于马来酰亚胺功能的琼脂糖凝胶基蛋白微阵列免疫传感器的制备方法及应用
摘要：	本发明涉及一种基于马来酰亚胺功能的琼脂糖凝胶基蛋白微阵列免疫传感器的制备方法及应用，属于电化学传感与免疫分析领域；本发明采用有机合成法，用3‑马来酰亚胺基苯甲酸琥珀酰亚胺酯（MBS）活化琼脂糖凝胶（AG），利用重组蛋白A的C端半胱氨酸巯基与MBS中的不饱和羰基间的特异性识别形成稳定硫醚键而构建一种蛋白基微阵列；该法能够有效维持蛋白A二级、三级结构稳定，同时将能够识别抗体Fc域的N端充分暴露，提升固定抗体的活性；再结合电致化学发光免疫传感策略，能够实现疾病标志物的超灵敏检测；该传感器构建简单，成本消耗低，灵敏度高，检测范围宽，临床应用潜力大。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	山东;37
申请人：	济南大学
发明人：	魏琴;贾越;杨磊;赵磊;任祥;张诺;马洪敏
专利状态：	有效
申请日期：	2019-10-09T00:00:00+0800
发布日期：	2019-11-26T00:00:00+0800
申请号：	CN201910952259.9
公开号：	CN110501407A
代理机构：	济南誉丰专利代理事务所(普通合伙企业)
代理人：	赵凤
分类号：	G01N27/327(2006.01);G;G01;G01N;G01N27
申请人地址：	250022 山东省济南市市中区南辛庄西路336号
主权项：	1.一种基于马来酰亚胺功能的琼脂糖凝胶基蛋白微阵列免疫传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）将玻碳电极分别在乙醇和去离子水中超声清洗30 s，依次用1.0 μm, 0.3 μm和0.05 μm的Al2O3抛光粉对其抛光使之类似镜面般光滑，用氮气吹干；（2）在玻碳电极上滴涂3 ~ 6 μL MBS-AG，常温下晾干；（3）将上述电极浸入浓度为50 ~ 100 ng/mL的重组蛋白A溶液中30 ~ 60 min，构建蛋白微阵列，4 °C晾干后用pH 7.4的PBS冲洗电极表面；（4）在电极表面滴涂6 μL、浓度为2 ~ 5 mg/mL的Ab1溶液，4 °C晾干后用pH 7.4的PBS冲洗电极表面；（5）滴加3 μL、质量分数为0.1%的牛血清白蛋白溶液，以封闭电极表面的非特异性活性位点，4 °C晾干后用pH 7.4的PBS冲洗电极表面；（6）滴加6 μL标准抗原溶液或未知浓度抗原溶液，37 °C下孵化2 h，4 °C晾干后用pH7.4的PBS冲洗电极表面；（7）滴加6 μL Ni NCs-Ab2溶液，4 °C晾干后用pH 7.4的PBS冲洗电极表面，传感器构建完毕。 2.如权利要求1所述的一种基于马来酰亚胺功能的琼脂糖凝胶基蛋白微阵列免疫传感器的制备方法，所述MBS-AG，按以下步骤制备：取出一定体积保存于20%乙醇溶液中的琼脂糖凝胶于布氏漏斗中，用超纯水洗净后抽滤20 min；称取10 ~ 30 g琼脂糖凝胶，置于250 mL锥形瓶中，再分别加入2 ~ 5 mL环氧氯丙烷、30 ~ 50 mL 2.5M NaOH（含0.02% NaBH4）, 将锥形瓶放入恒温摇床35 oC （150 rmp）震荡反应4 h；反应结束后用大量的蒸馏水洗净冲干转移至150 mL锥形瓶，分别加入1 ~ 10mL乙二胺和10 ~ 100 mL 0.1 M pH为9硼酸缓冲液于50 oC反应3 h；反应结束后用大量蒸馏水洗净抽干转移至250 mL锥形瓶，加入10 ~ 100 mL 20 mM pH为7.2的磷酸缓冲液；称取0.01 ~ 0.05 g MBS于25 mL烧杯中，用移液管量取1 ~ 10 mL二甲基亚飒至烧杯中，MBS溶解之后将溶液倒入锥形瓶，残留的溶液使用15 mL 20 mM pH为7.2的磷酸缓冲液分三次润洗后倒入锥形瓶中，再将锥形瓶放入恒温摇床35 oC (150 rmp)震荡反应4 h。 3.如权利要求1所述的一种基于马来酰亚胺功能的琼脂糖凝胶基蛋白微阵列免疫传感器的制备方法，所述信号标签Ni NCs- Ab2，按以下步骤制备：室温下，将5 mL、浓度为5 ~ 10 mmol/L 的硝酸镍溶液与5 mL、浓度为50 ~ 100 mg/mL的牛血清蛋白溶液充分混合，有力搅拌2 ~ 5 min后，加入0.5 ~ 1 mL、浓度为1 mol/L的氢氧化钠溶液调节pH=12，然后将该混合液置于68 oC 水浴中8 h，直至溶液颜色变为深黄色，此时，镍离子根离子已被BSA成功还原，随后，将上述溶液倒入孔径为3500 kDa透析袋，透析48 h，得到中性的Ni NCs；取2 mL制备好的Ni NCs，加入1 ~ 5 μL、浓度为 1 ~ 10 mg/mL的EDC/NHS混合液，震荡5 min，加入100 ~ 300 μL、浓度为10 mg/mL的Ab2溶液，在4 °C下振荡孵化12 h，离心后分散到1 mL pH 7.4的PBS缓冲溶液中得到Ni NCs-Ab2溶液，置于4 °C下储存备用。 4.如权利要求1所述的一种基于马来酰亚胺功能的琼脂糖凝胶基蛋白微阵列免疫传感器的制备方法，其特征在于，所述抗原与抗体为阿尔兹海默症标志物β-淀粉样蛋白及其对应的抗体。 5.如权利要求4所述的检测β-淀粉样蛋白的浓度，其特征在于，步骤如下：（1）超微弱发光检测仪参数设置：光电倍增管高压设置为600 ~ 800 V，放大级数III；（2）电化学工作站参数设置：循环伏安法扫描电位范围0.5 ~ 1.2 V，扫描速率为0.1V/s；（3）测试：以Ag/AgCl电极作为参比电极，铂丝电极为对电极，以传感器为工作电极，在7~ 10 mL含200 ~ 300 mM三乙胺的PBS溶液中进行ECL测试，根据孵化不同浓度β-淀粉样蛋白时产生的ECL信号强度绘制工作曲线。
所属类别：	发明专利