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原文传递一种昆虫体内生物素含量测定方法

专利名称：	一种昆虫体内生物素含量测定方法
摘要：	本发明涉及一种昆虫体内生物素含量测定方法，包括以下步骤：（1）昆虫样品提取处理；（2）配制生物素梯度溶液；（3）制备生物素测定培养液；（4）生物素测定；本检测方法所用的植物乳酸杆菌、各类培养基等均为市场常见菌株或耗材，成本低，显著降低生物素检测的成本，培养方法简单；本发明检测时间为22小时，比商业化试剂盒检测时间缩短了22‑26小时，提高了昆虫维生素检测的效率。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	辽宁;21
申请人：	沈阳农业大学
发明人：	栾军波;任飞荣;白冰
专利状态：	有效
申请日期：	2019-09-10T00:00:00+0800
发布日期：	2019-12-27T00:00:00+0800
申请号：	CN201910850178.8
公开号：	CN110618281A
代理机构：	沈阳科威专利代理有限责任公司
代理人：	张述学
分类号：	G01N33/82(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	110866 辽宁省沈阳市沈河区东陵路120号
主权项：	1.一种昆虫体内生物素含量测定方法，其特征是：包括以下步骤：（1）昆虫样品提取处理取20-50 mg 昆虫样品，用100μL柠檬酸盐缓冲液研磨，加入1mol/L硫酸200μL；95度水浴2h，期间震荡5次，用浓度为2mol/L氢氧化钠溶液调节pH至7，并定容至5ml；（2）配制生物素梯度溶液 a. 制备浓度为100 μg/mL生物素标准储备液； b. 制备浓度为1 μg/mL生物素标准中间液； c. 制备浓度为10 ng/mL生物素标准工作液； d. 制备浓度为0.0-0.8 ng/mL的生物素梯度溶液；（3）制备生物素测定培养液 a. 微生物菌株的制备所述微生物菌株为植物乳杆菌（Lactobacillus Plantarum）；所述植物乳杆菌的培养基为乳酸杆菌琼脂培养基和乳酸杆菌肉汤培养基；所述植物乳杆菌菌株培养方法：对植物乳杆菌进行3-5代菌株培养；所述第1代植物乳杆菌菌株培养采用乳酸杆菌琼脂培养基上划线培养，37℃培养18h；所述第2代植物乳杆菌菌株培养：挑取第一代单菌落于乳酸杆菌肉汤培养基中，37℃培养18h，得到乳酸杆菌肉汤菌液；所述第3代植物乳杆菌菌株培养：取第2代乳酸杆菌肉汤菌液于乳酸杆菌肉汤培养基中，37℃培养18h；所述第4代和第5代植物乳杆菌菌株培养，按照第3代培养方法，均取上一代植物乳酸杆菌肉汤菌液至乳酸杆菌肉汤培养基中进行培养，37℃培养18h；所述第3-5植物乳酸杆菌肉汤菌液2200rpm离心，3min；弃上清液，加生理盐水混匀洗菌，重复洗菌3次后，用生理盐水调菌液OD630nm：0.8-0.95，得到备用植物乳酸杆菌菌液； b. 生物素测定培养液的制备将游离生物素培养基于95℃水浴30min，迅速降至室温，每隔10min，摇匀一次；过滤灭菌代用；将上述备用植物乳酸杆菌菌液按1﹕100比例加入游离生物素培养基培养基中混匀，得到生物素测定培养液；（4）生物素测定 a. 样品处理将昆虫样品和生物素梯度浓度溶液分别与生物素测定培养液混合，质量体积比为昆虫样品或生物素梯度浓度溶液﹕生物素测定培养液=1﹕1，将上述处理样品均置于37 ℃培养22h后，取各样品至于洁净的微孔板中，630nm测定OD值； b. 建立生物素测定标准曲线根据各生物素梯度浓度溶液与生物素测定培养液混合培养后测定得到的OD值，以生物素含量（ng）标准系列为横坐标，以630nm光密度值为纵坐标，绘制标准曲线，得到标准曲线线性方程； c. 昆虫样品中生物素含量计算以昆虫样品与生物素测定培养液混合培养后测定得到的OD值为生物素测定标准曲线的Y值，在标准曲线上查出相对应的生物素浓度（标准曲线的x值），各昆虫样品的生物素含量通过下列公式计算：其中： N: 样品中生物素的含量，单位为纳克每毫克（ng/mg）； c:生物素测定标准曲线上计算所得生物素的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）； v：步骤（1）样品提取后定容体积，单位为毫升（ml）； m：昆虫质量，单位为毫克（mg）； F：样品提取后定容体积的稀释倍数。 2.根据权利要求1所述的一种昆虫体内生物素含量测定方法，其特征是：所述昆虫为半翅目昆虫。 3.根据权利要求1所述的一种昆虫体内生物素含量测定方法，其特征是：所述步骤（2）中生物素梯度溶液浓度依次为0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.6、0.8 ng/mL的生物素梯度溶液。 4.根据权利要求1所述的一种昆虫体内生物素含量测定方法，其特征是：通过所述测定方法测得昆虫生物素含量超过1.0 ng/mL时，将步骤（1）中昆虫样品提取定容体积进行稀释，再进行步骤（4）；昆虫生物素含量低于0.1 ng/mL时，重新提取昆虫样品或增加昆虫样品质量，再进行步骤（4）。
所属类别：	发明专利