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原文传递一种C反应蛋白全程检测的方法以及相应的试剂盒

专利名称：	一种C反应蛋白全程检测的方法以及相应的试剂盒
摘要：	本发明提供了一种基于化学发光免疫分析的C反应蛋白全程检测的试剂盒以及C反应蛋白全程检测方法。该试剂盒包含R1试剂、M试剂、R2试剂、预激发液和激发液。该R1试剂即样品处理液为0.5M柠檬酸溶液(pH3.0‑3.5，用十二水磷酸氢二钠调节)。本发明还提供一种C反应蛋白全程检测试剂盒，其包含包被第一抗体的平底板式化学发光板、样品处理液、辣根过氧化酶(HRP)或碱性磷酸酶(AP)标记的第二抗体、显色液。本发明还提供使用所述试剂盒进行C反应蛋白全程检测的方法。所述第一抗体和第二抗体均为能与C反应蛋白特异性反应的单克隆抗体。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	福建;35
申请人：	厦门万泰凯瑞生物技术有限公司
发明人：	陈自敏;熊君辉;徐伟玲;翁祖星;王龙;郑小红;孙旭东;葛胜祥
专利状态：	有效
申请日期：	2018-06-20T00:00:00+0800
发布日期：	2019-12-27T00:00:00+0800
申请号：	CN201810634120.5
公开号：	CN110618263A
代理机构：	中国国际贸易促进委员会专利商标事务所
代理人：	张小勇
分类号：	G01N33/543(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	361022 福建省厦门市海沧区新阳街道新园路124号2楼
主权项：	1.一种C反应蛋白全程检测试剂盒，其包含： M试剂，含有0.5～1mg/mL的包被了第一抗体的磁性微粒、0.04～0.06％(w/v)表面活性剂(所述表面活性剂任选为吐温20)和8～12％(w/v)蔗糖，溶剂为pH＝7.0～8.0的磷酸盐缓冲液；其中第一抗体的包被量为5～20μg/mg磁性微粒； R1试剂，即样品处理液，浓度为0.1～1M的柠檬酸溶液，pH＝3.0～4.0； R2试剂，含有包被了第二抗体的吖啶酯、0.5～1％酪蛋白和0.5～1％牛血清白蛋白，溶剂为pH＝7.0～8.0的磷酸盐缓冲液，其中第二抗体的包被量为0.3-0.9μg/μg吖啶酯；预激发液和激发液；所述第一抗体和第二抗体均为能与C反应蛋白特异性反应的单克隆抗体，所述第一抗体和第二抗体针对不同的表位。 2.一种C反应蛋白全程检测试剂盒，其包含：包被第一抗体的平底板式化学发光板，含有板式发光板(任选96孔、384孔等板式发光板)，其中第一抗体的包被量为100～500ng/孔(任选500ng/孔)，包被缓冲液为pH＝7.0～8.0的磷酸盐缓冲液，封闭液为5-8％(w/v)封闭血清或封闭蛋白质(所述封闭血清任选为小牛血清)和0.02％(w/v)叠氮化钠、pH值为7.2-7.4的50mM磷酸缓冲液；样品处理液，浓度为0.1～1M的柠檬酸溶液，pH＝3～4；标记酶液，含有标记了辣根过氧化物酶或者碱性磷酸酶的第二抗体，标记量为第二抗体1mg/mL，与辣根过氧化酶或者碱性磷酸酶同比例标记；显色液：当标记酶为辣根过氧化酶时，显色液包括显色A液和显色B液，显色A液为过氧化氢(任选地，显色A液的配方：醋酸钠13.6g，柠檬酸1.6g，30％双氧水0.3ml，蒸馏水配制至500ml)，显色B液为邻苯二胺(任选地，显色B液的配方：乙二胺四乙酸二钠0.2g，柠檬酸0.95g，甘油50ml，9.15g四甲基联苯胺，蒸馏水配制至500ml)；当标记酶为碱性磷酸酶时，显色液为市售试剂；所述第一抗体和第二抗体均为能与C反应蛋白特异性反应的单克隆抗体，所述第一抗体和第二抗体针对不同的表位。 3.权利要求1或2所述的试剂盒，其中柠檬酸的pH是通过十二水磷酸氢二钠调节，优选地，柠檬酸的pH为3.0-3.5，更优选地，柠檬酸的pH为3.2、3.3、3.4或3.5。 4.权利要求1至3中任一项所述的试剂盒，其中柠檬酸的浓度是0.5mol/L。 5.权利要求1至4中任一项所述的试剂盒，其中预激发液为1％(w/v)过氧化氢溶液，激发液为1mol/L氢氧化钠溶液，任选地，第一抗体为10C11，第二抗体为14D9-2。 6.权利要求1至5中任一项所述的试剂盒，其中：所述M试剂的制备方法：将所述第一抗体与磁性微粒混合pH＝5.0～6.0的2-吗啉乙磺酸缓冲液中，于25-37℃包被1-3h，加入pH＝8.0～9.0的0.1％～0.5％(w/v)牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液终止1～3h，将其中包被后的磁珠微粒分离后分散于pH＝7.0～8.0的磷酸盐缓冲液中，再加入0.04～0.06％(w/v)表面活性剂(所述表面活性剂任选为吐温20，在一个实施方案中为所述表面活性剂0.05％(w/v)吐温20)和8～12％(w/v)蔗糖(任选地，10％(w/v)蔗糖)，即得M试剂；所述R2试剂的制备方法：将所述第二抗体与吖啶酯混合于pH＝8.0～9.0的磷酸盐缓冲液中，于25-37℃包被1～3h，再加入pH＝8.0～9.0的含有0.1％～0.5％(w/v)牛血清白蛋白的Tris缓冲液终止1～3h，得到母液，母液用pH＝7.0～8.0的磷酸盐缓冲液稀释至1:100～500，即得R2试剂。 7.权利要求1至6中任一项所述的试剂盒，其中：所述发光板包被原的制备方法为：将包被第一抗体用包被缓冲液为pH＝7.0～8.0的磷酸盐缓冲液稀释至100～500ng/孔(任选500ng/孔)，每孔100μL加入到发光板上，37℃温育2h或者4℃过夜，倾去包被液，用200μL为5-8％(w/v)小牛血清和0.02％(w/v)叠氮化钠的封闭液37℃温育2h，倾去孔内液体，干燥后用铝膜真空密封，4℃干燥处保存；所述标记酶液的制备方法：将所述第二抗体与辣根过氧化酶或者碱性磷酸酶1:1混合标记透析于pH＝9.6的碳酸盐缓冲液中，4h更换一次透析缓冲液，更换3次，收集酶标第二抗体即为母液，而后将母液用市售酶稀释液1:500稀释，即得标记酶液。 8.一种C反应蛋白全程检测的方法，其使用权利要求1至7任一项所述的试剂盒进行，其包括： (1)取20μL样品加入100μL的R1试剂，处理样品； (2)再加入50μL的M试剂，共同孵育15min； (3)步骤(2)结束后，用含有0.05～0.08％(w/v)的吐温20磷酸盐缓冲液洗涤，再加入50μL的R2试剂，孵育10min； (4)步骤(3)结束后，用含有0.05～0.08％(w/v)的吐温20磷酸盐缓冲液洗涤，加入100μL预激发液，进行预激发。 (5)去除预激发液，加入100μL激发液，进行激发和检测。 9.柠檬酸溶液作为样品处理液在制备C反应蛋白全程检测试剂盒中的用途。 10.权利要求9所述的用途，其中柠檬酸溶液为浓度为0.1～1M的柠檬酸溶液，pH＝3～4；优选地，柠檬酸的pH是通过十二水磷酸氢二钠调节，更优选地，柠檬酸的pH为3.0-3.5，更优选地，柠檬酸的pH为3.2、3.3、3.4或3.5。
所属类别：	发明专利