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原文传递一种HPLC-ICP-MS法测定粒细胞中四种砷化合物浓度的方法及应用

专利名称：	一种HPLC-ICP-MS法测定粒细胞中四种砷化合物浓度的方法及应用
摘要：	本发明涉及一种HPLC‑ICP‑MS法测定粒细胞中四种砷化合物浓度的方法及应用，属于血液样本检测技术领域。为解决现有方法无法准确测定粒细胞内AsIII、AsV、DMAV和MMAV四种不同砷化合物的浓度的问题，本发明提供了一种HPLC‑ICP‑MS法测定粒细胞中四种砷化合物浓度的方法，包括确定检测条件、配制标准溶液、绘制标准曲线、收集与处理粒细胞样本、样本检测与数据处理。本发明能够有效提取粒细胞内各砷化合物并进行准确定量。将本发明应用于检测APL患者外周血粒细胞内四种砷化合物浓度，可以明确各砷形态的代谢及分布特征，为揭示亚砷酸作用机制、减少毒性反应提供技术基础，辅助临床实现个体化用药和靶向治疗。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	黑龙江;23
申请人：	哈尔滨医科大学
发明人：	海鑫;于凯江;王新羽;郭美华
专利状态：	有效
申请日期：	2019-11-05T00:00:00+0800
发布日期：	2019-12-31T00:00:00+0800
申请号：	CN201911071239.7
公开号：	CN110632217A
代理机构：	哈尔滨市伟晨专利代理事务所(普通合伙)
代理人：	刘坤
分类号：	G01N30/02(2006.01);G;G01;G01N;G01N30
申请人地址：	150086 黑龙江省哈尔滨市南岗区一曼街141号哈尔滨医科大学附属第一医院
主权项：	1.一种HPLC-ICP-MS法测定粒细胞中四种砷化合物浓度的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一、确定HPLC-ICP-MS检测条件：步骤二、配制AsIII、MMAV、DMAV和AsV四种砷化合物的标准溶液：步骤三、绘制四种砷化合物的标准曲线：步骤四、收集与处理粒细胞样本： (1)收集粒细胞样本：从全血样本中提取白细胞，在所得白细胞样本中加入抗体进行孵育，孵育后所得样本经分选得到粒细胞样本； (2)处理粒细胞样本：取所得粒细胞样本，用HPLC流动相进行稀释，加入质量浓度为5％的氨水，充分混匀得到处理液，再将质量浓度为30％的双氧水加入所述的处理液中，涡旋混匀，静置20min，得到预处理样本，按一定体积比将预处理样本与质量浓度为20％的高氯酸混匀并置于4℃条件下高速离心，取上清液用0.22μm滤膜过滤得到检测样本；步骤五、样本检测与数据处理。 2.根据权利要求1所述一种HPLC-ICP-MS法测定粒细胞中四种砷化合物浓度的方法，其特征在于，步骤一所述HPLC-ICP-MS检测条件为：高效液相色谱条件：阴离子交换色谱柱：Hamilton PRP-X100，150mm×4.1mm，5μm；流速：0.9mL/min；流动相：3mmol/L无水磷酸二氢钠，13mmol/L无水乙酸钠，0.2mmol/L乙二胺四乙酸二钠和4mmol/L硝酸钾组成的混合溶液；进样体积为50μL；电感耦合等离子体质谱条件：检测模式：DRC加氧模式，喷雾器气流量：0.9L/min，辅助气流量：1.2L/min，等离子气流量：18L/min，电感耦合等离子射频功率：1600W，氧气流量：0.6ml/min。 3.根据权利要求1或2所述一种HPLC-ICP-MS法测定粒细胞中四种砷化合物浓度的方法，其特征在于，步骤二所述四种砷化合物的标准溶液中AsIII、DMAV、MMAV的标准溶液中砷化合物的浓度均依次为64、32、16、4、1和0.5ng/mL，AsV的标准溶液中砷化合物的浓度依次为128、64、32、16、4和1ng/mL。 4.根据权利要求3所述一种HPLC-ICP-MS法测定粒细胞中四种砷化合物浓度的方法，其特征在于，步骤三所述四种砷化合物的标准曲线方程分别为： AsIII：y＝9924.3x+644.46，r2＝1，线性范围为0.50～64ng/ml； DMAV：y＝14625x+2914.6，r2＝1，线性范围为0.50～64ng/ml； MMAV：y＝13488x+2616.2，r2＝1，线性范围为0.50～64ng/ml； AsV：y＝14060x+10134，r2＝0.9999，线性范围为1～128ng/ml。 5.根据权利要求4所述一种HPLC-ICP-MS法测定粒细胞中四种砷化合物浓度的方法，其特征在于，步骤四(1)所述的提取白细胞的方法为将全血样本与红细胞裂解液按体积比为1：10混合破碎红细胞，混匀后静置15min，离心取上清，清洗所得沉淀即获得白细胞样本。 6.根据权利要求5所述一种HPLC-ICP-MS法测定粒细胞中四种砷化合物浓度的方法，其特征在于，步骤四(1)所述的抗体为FITC-A CD14、PerCP-ACD45、APC-ACD3和APC-A CD19。 7.根据权利要求6所述一种HPLC-ICP-MS法测定粒细胞中四种砷化合物浓度的方法，其特征在于，所述抗体的添加量为每1mL全血提取所得白细胞样本中加入FITC-A CD1410μl、PerCP-ACD4510μl、APC-ACD33μl和APC-ACD193μl。 8.根据权利要求7所述一种HPLC-ICP-MS法测定粒细胞中四种砷化合物浓度的方法，其特征在于，步骤四(1)所述孵育为暗处孵育15min。 9.根据权利要求8所述一种HPLC-ICP-MS法测定粒细胞中四种砷化合物浓度的方法，其特征在于，步骤四(2)所述流动相、5％氨水和30％双氧水的加入量为每1mL全血提取所得粒细胞样本加入流动相49μl、5％氨水1μl、30％双氧水50μl；所述预处理样本与所述20％高氯酸的体积比为90：10；所述高速离心为4℃条件下13200rpm离心15min。 10.权利要求1-9任一所述一种HPLC-ICP-MS法测定粒细胞中四种砷化合物浓度的方法在检测砷剂治疗的APL患者外周血粒细胞内四种砷化合物浓度中的应用。
所属类别：	发明专利