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原文传递一种基于酶学系统组合多种体外模型评价皮肤抗衰老功效的方法

专利名称：	一种基于酶学系统组合多种体外模型评价皮肤抗衰老功效的方法
摘要：	本发明公开了一种基于酶学系统组合多种体外模型评价皮肤抗衰老功效的方法，包括以下步骤：(一)基于化学水平的抗衰老功效预测；(二)基于细胞水平的抗衰老功效预测；(三)基于3D皮肤模型的抗衰老功效预测；(四)基于酶学系统组合多种体外模型评价皮肤抗衰老功效预测模型的建立；该方法可全面体现受试物在酶学系统中的多水平的表达，非动物测试，可以对受试物进行全面的抗衰老功效预测，数据信息丰富，能广泛应用。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	广东;44
申请人：	广州市华代生物科技有限公司
发明人：	杜娟;程树军;冯鉴鸿
专利状态：	有效
申请日期：	2019-08-27T00:00:00+0800
发布日期：	2019-12-31T00:00:00+0800
申请号：	CN201910799522.5
公开号：	CN110632303A
代理机构：	广州知友专利商标代理有限公司
代理人：	周克佑;刘艳丽
分类号：	G01N33/573(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	510530 广东省广州市黄埔区开源大道11号B3座906
主权项：	1.一种基于酶学系统组合多种体外模型评价皮肤抗衰老功效的方法，其特征是包括以下步骤： (一)基于酶学系统在化学水平方面抗衰老功效预测：采用弹性蛋白酶抑制试验、胶原蛋白酶抑制试验、基质金属蛋白酶-1抑制试验或透明质酸酶抑制试验来确定受试物是否具有抗衰老作用，设置不同浓度的受试物，加入上述不同酶，不同浓度的受试物与酶水平变化呈现剂量-效应关系，且变化水平具有统计学意义(P<0.05)，表明该物质具有抗衰老作用，反之则不具有抗衰老作用； (二)基于酶学系统在细胞水平方面抗衰老功效预测： (2.1)正常人皮肤原代细胞的分离、培养和鉴定：以离体包皮为原料，经分离、培养和鉴定，获得正常人皮肤原代细胞； (2.2)受试物的配制及受试物浓度的确定：将受试物配制一组具有浓度梯度的溶液，当正常人原代细胞的细胞密度长至80％时，将该组具有浓度梯度的受试物，分别加入多个正常人原代细胞中形成受试物组，并分别设置空白对照以及阴性对照，按照MTT法，测试细胞的活性，用酶标仪测试各组的吸光度，按照公式：细胞活性＝(受试物吸光度值－空白对照吸光度值)/(阴性对照吸光度值—空白对照吸光度值)×100％，选取细胞活性＞80％的受试物浓度为最高试验浓度，以最高试验浓度或连续向下稀释2-3个浓度进行测试； (2.3)紫外线诱导辐射剂量的确定：正常人原代细胞的细胞密度长至80％时，设置具有梯度的UVA或UVB辐照量，按具有梯度的UVA或UVB辐照量分别照射多个正常人原代细胞形成辐照组，并设置空白对照和阴性对照，按照MTT法，测试细胞的活性，利用酶标仪测试辐照组、空白对照以及阴性对照的吸光度，根据公式：细胞活性＝(辐照组吸光度值－空白对照吸光度值)/(阴性对照吸光度值—空白对照吸光度值)×100％，选取细胞活性在70％的辐照剂量进行抗衰老效果试验； (2.4)受试物抗衰老效果的确认：根据步骤(2.2)确定的受试物浓度和步骤(2.3)中确定的UVA或UVB辐照剂量，待正常人原代细胞长至80％时，分别设立空白对照、阴性对照、阳性对照、辐照组和实验组，利用酶标仪测试各组的同步骤(一)中弹性蛋白酶、胶原蛋白酶、基质金属蛋白酶或透明质酸酶水平，并根据测试结果，判断各产品的抗衰老效果，与辐照组相比，不同浓度的受试物与细胞酶水平变化呈现剂量-效应关系，且一个或多个浓度变化水平具有统计学意义(P<0.05)，表明该物质具有抗衰老作用，反之，则不具有抗衰老作用； (三)基于酶学系统在3D皮肤模型方面的抗衰老功效预测： (3.1)3D皮肤模型的建立：3D皮肤模型购买获得或实验室根据常规方法自备； (3.2)受试物的配制及受试物浓度的确定：除采用3D皮肤模型外，其余同步骤(2.2)； (3.3)紫外线诱导辐射剂量的确定：除采用3D皮肤模型外，其余同步骤(2.3)； (3.4)受试物抗衰老效果的确认：除采用3D皮肤模型外，其余同步骤(2.4)； (四)基于酶学系统组合多种体外方法评价皮肤抗衰老功效预测模型的建立： 2.根据权利要求1所述的基于酶学系统组合多种体外模型评价皮肤抗衰老功效的方法，其特征是：步骤(一)～步骤(三)中所述受试物为化妆品、植物提取物、药品、食品添加剂、农药、生物制品或化学品。 3.根据权利要求1所述的基于酶学系统组合多种体外模型评价皮肤抗衰老功效的方法，其特征是：步骤(2.1)中所述的正常人皮肤原代细胞为正常人原代角质细胞或正常人原代成纤维细胞。 4.根据权利要求1所述的基于酶学系统组合多种体外模型评价皮肤抗衰老功效的方法，其特征是：步骤(2.2)～(2.4)中用酶标仪在550～570nm处分别测试各组的吸光度。 5.根据权利要求1所述的基于酶学系统组合多种体外模型评价皮肤抗衰老功效的方法，其特征是：步骤(2.3)和步骤(3.3)中确定的辐照剂量为：UVA辐射强度为8～10J/cm2，UVB辐照强度为0.6～0.8J/cm2。 6.根据权利要求1所述的基于酶学系统组合多种体外模型评价皮肤抗衰老功效的方法，其特征是：步骤(2.2)～步骤(2.4)中所述的阴性对照中含有正常人原代细胞和细胞培养液并不经紫外线照射，所述的空白对照中仅含有正常人皮肤原代细胞的培养液并不经紫外线照射；步骤(2.4)中所述阳性对照中含有已知的抗衰老物质、正常人原代细胞和正常人皮肤原代细胞的培养液并经紫外线照射，所述辐照组中含有正常人原代细胞和正常人皮肤原代细胞的培养液并经紫外线照射，所述受试物组含有受试物、正常人原代细胞和正常人皮肤原代细胞的培养液并经紫外线照射。 7.根据权利要求1所述的基于酶学系统组合多种体外模型评价皮肤抗衰老功效的方法，其特征是：步骤(3.2)～步骤(3.4)中所述的阴性对照中含有3D皮肤模型和3D皮肤模型的培养液并不经紫外线照射，所述的空白对照中仅含有3D皮肤模型的培养液并不经紫外线照射；步骤(3.4)中所述阳性对照中含有已知的抗衰老物质、3D皮肤模型和3D皮肤模型的培养液并经紫外线照射，所述辐照组中含有3D皮肤模型和3D皮肤模型的培养液并经紫外线照射，所述受试物组含有受试物、3D皮肤模型和3D皮肤模型的培养液并经紫外线照射。 8.根据权利要求6或7所述的基于酶学系统组合多种体外模型评价皮肤抗衰老功效的方法，其特征是：所述已知的抗衰老物质为表没食子儿茶素没食子酸酯、维生素E或维生素C。 9.根据权利要求1所述的基于酶学系统组合多种体外模型评价皮肤抗衰老功效的方法，其特征是：步骤(2.4)中以及步骤(3.4)中利用ELISA试剂盒测试弹性蛋白酶、胶原蛋白酶、基质金属蛋白酶或透明质酸酶水平。 10.根据权利要求1所述的基于酶学系统组合多种体外模型评价皮肤抗衰老功效的方法，其特征是：步骤(四)中基于权重的原则，基于3D皮肤模型的抗衰老功效预测＞基于细胞水平的抗衰老功效预测＞基于化学水平的抗衰老功效预测，在三种抗衰老功效预测不一致的情况下，以权重高的抗衰老功效预测为主要判断依据。
所属类别：	发明专利