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原文传递一种石蒜碱作为检测羟自由基荧光探针的测定方法

专利名称：	一种石蒜碱作为检测羟自由基荧光探针的测定方法
摘要：	本发明公开了一种石蒜碱作为检测羟自由基荧光探针的测定方法，通过石蒜碱对羟自由基的荧光响应，以及石蒜碱的荧光强度与加入的羟自由基量的关系，能够对微摩尔级的羟自由基进行精确定量。具体包括以下步骤：首先确定石蒜碱的激发与发射波长，然后对石蒜碱进行不同离子，不同浓度过氧化氢和不同浓度羟自由基的荧光响应检测，得出1.176μM的石蒜碱对过氧化氢与硫酸亚铁产生的羟自由基有响应，可以作为羟自由基的荧光探针，其对过氧化氢没有荧光响应，不能够作为过氧化氢的荧光探针及石蒜碱的荧光强度与所加的羟自由基浓度存在着二次函数关系，说明石蒜碱可以作为羟自由基的荧光探针，检测很灵敏，可以对微摩尔级的羟自由基进行精确地定量。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	天津;12
申请人：	朱彧
发明人：	朱彧;张斌;王远宏;徐立婧;张丽霞
专利状态：	有效
申请日期：	2019-08-16T00:00:00+0800
发布日期：	2019-12-31T00:00:00+0800
申请号：	CN201910755894.8
公开号：	CN110632041A
代理机构：	天津展誉专利代理有限公司
代理人：	郑晓晨
分类号：	G01N21/64(2006.01);G;G01;G01N;G01N21
申请人地址：	300000 天津市和平区成都道朗文名邸4号楼1门1602号
主权项：	1.一种石蒜碱作为检测羟自由基荧光探针的测定方法，其特征在于：包括以下步骤： (1)确定石蒜碱的激发与发射波长：使用荧光分光光度计进行检测，在四面光比色皿中加入3200μL浓度为0.6623μM的石蒜碱溶液，开始设置参数先选定一个激发波长为360nm，扫描波长范围设为380-640nm，发现石蒜碱最大激发波长为248nm，最大发射波长为410nm， (2)对石蒜碱进行不同离子荧光响应的检测：将所确定的激发波长248nm设置为固定值，扫描范围为258nm-478nm开始扫描，所得的曲线为石蒜碱原溶液的荧光曲线，然后依次在含有1.176μM的石蒜碱溶液中依次加入20μL浓度为10mM的氯化钙、氯化钾、硫酸镁、次氯酸钠、过氧化氢、硫酸亚铁溶液，并进行扫描，得出不同离子对石蒜碱溶液的荧光响应图，保存数据， (3)不同浓度过氧化氢对石蒜碱的荧光响应检测：在四面光比色皿中加入3400μL浓度为1.176μM的石蒜碱溶液，设置激发波长为248nm，扫描范围为258nm-478nm进行扫描，得到石蒜碱原溶液曲线，之后在比色皿中依次加入20μL的10μM、200μM、500μM、50mM、80mM、100mM、500mM的过氧化氢溶液，并进行扫描，得到不同浓度对石蒜碱溶液的荧光响应图，将扫描得到的数据保存， (4)不同浓度的羟自由基对石蒜碱的荧光响应检测：羟自由基由3％过氧化氢与硫酸亚铁反应产生，先对石蒜碱原溶液进行扫描，在四面光比色皿中加入3400μL浓度为1.176μM的石蒜碱溶液，设置激发波长为248nm，扫描范围为258nm-478nm，得到石蒜碱原溶液荧光曲线，先加入20μL10mM的过氧化氢，开始扫描，扫描结束后等待2-5分钟再次扫描，直至荧光曲线稳定不再变化，删除加入的过氧化氢曲线；然后加入20μL2.5mM硫酸亚铁溶液，开始扫描，此时得到的曲线是5s后0.1162mM羟基自由基对石蒜碱溶液的荧光响应图，等待5分钟后再次扫描，记录保存所出现的曲线图；继续加入20μL10mM的过氧化氢进行扫描，观察曲线直至不再变化再删除；再加入20μL10mM硫酸亚铁溶液，进行扫描得到5s和5min的0.1449mM羟基自由基对石蒜碱溶液的荧光响应图，直至加入的羟基自由基的浓度为0.3954mM时不再继续加，记录保存所得5s和5min的曲线图以及数据以便后期进行数据分析。 2.根据权利要求1所述的石蒜碱作为检测羟自由基荧光探针的测定方法，其特征在于：在步骤(2)中，为了验证不同的离子对石蒜碱的荧光响应，将20μL浓度为5.8μM的KCl、MgSO4，5.7μM的CaCl2、NaClO、H2O2分别加入到含有1.176μM的石蒜碱中，以248nm为EX，EM为414nm，由荧光光谱变化图得出在最大发射波长414nm处的荧光强度没有变化，当加入20μM浓度为5.6μM的FeSO4后荧光强度有所下降，继续加入20μL浓度为5.7μM的过氧化氢时荧光强度没有变化，当再加入20μL浓度为5.6μM的FeSO4时荧光强度又开始下降，是因为石蒜碱对过氧化氢与硫酸亚铁产生的羟自由基有荧光响应。 3.根据权利要求1所述的石蒜碱作为检测羟自由基荧光探针的测定方法，其特征在于：在步骤(3)中，为了验证石蒜碱对过氧化氢的荧光响应，将20μL不同浓度的过氧化氢依次加入到含有1.176μM的石蒜碱中，以248nm为EX，EM为414nm，观察到随着加入过氧化氢浓度的不同，石蒜碱的荧光强度与没有加过氧化氢的荧光强度相比有所下降，但是变化很微小。 4.根据权利要求1所述的石蒜碱作为检测羟自由基荧光探针的测定方法，其特征在于：在步骤(4)中，由5分钟后荧光光谱变化图得出，在浓度为1.176μM的石蒜碱中，以248nm为EX，EM为411nm，在没有加入羟自由基前，最大发射峰出现在414nm处，而当加入的羟自由基浓度为0.1162mM时，在EM为364nm开始出现了新峰，新的发射峰荧光强度为100nm，随着加入的羟自由基浓度不断增加，石蒜碱的荧光强度也在不断地增强，当加入的羟自由基量达到0.3954mM时，在364nm最大发射峰的荧光强度增强了8倍，石蒜碱荧光强度的增强与所加入的羟自由基浓度密切相关，且在浓度0.1449mM-0.3683mM之间有二次函数关系。
所属类别：	发明专利