详情

原文传递基于UHPLC-MS获取转基因和非转基因玉米代谢差异的方法

专利名称：	基于UHPLC-MS获取转基因和非转基因玉米代谢差异的方法
摘要：	本发明涉及基于UHPLC‑MS获取转基因和非转基因玉米代谢差异的方法，所述方法采用超高效液相色谱‑高分辨率质谱联用分析平台对玉米叶片提取液进行分析得到玉米叶片代谢轮廓，然后用多变量统计方法区分转基因和非转基因玉米数据，获得对代谢表型差异有重要贡献的化合物。所述方法操作简单，可进行高通量检测，尤其是检测分辨率高，可以消除干扰，实现高效可靠的代谢物信息识别，得到的结果更真实可靠。所述方法可以为深入研究转基因玉米的安全性提供根据。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	黑龙江;23
申请人：	黑龙江省农业科学院农产品质量安全研究所
发明人：	温洪涛;陈国峰;张晓磊;关海涛;张瑞英;李亮;张爱红;刘刚;黄莹盈;杜英秋
专利状态：	有效
申请日期：	2019-02-21T00:00:00+0800
发布日期：	2019-04-30T00:00:00+0800
申请号：	CN201910129965.3
公开号：	CN109696510A
代理机构：	北京路浩知识产权代理有限公司
代理人：	王文君;陈征
分类号：	G01N30/88(2006.01);G;G01;G01N;G01N30
申请人地址：	150086 黑龙江省哈尔滨市学府路368号创新大厦9楼
主权项：	1.基于UHPLC-MS获取转基因和非转基因玉米代谢差异的方法，其特征在于，包括如下步骤： 1)取转基因玉米和非转基因玉米叶片，粉碎至碎末状，然后进行提取，并加入内标物，获得含有内标物的待测样品；优选所述内标物为L-2-氯苯丙氨酸； 2)将所述待测样品进行UHPLC分离和Q Exactive Orbitrap质谱检测，获得所述转基因玉米和非转基因玉米的代谢物原始谱图信息； 3)采用LC-MS数据处理软件对步骤2)所获得的代谢物原始谱图信息进行提取，然后再采用正交偏最小二乘法-判别分析的统计方法进行分析，获得代谢指纹数据； 4)根据步骤3)获得代理指纹数据进行建模，获得OPLS-DA模型； 5)根据所述OPLS-DA模型，获得转基因和非转基因玉米的差异代谢物。 2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)具体为：取5～6叶期的玉米嫩叶，与液氮混合，研磨至碎末状，获得碎末样品；将所述碎末样品加入提取液中，并加入内标物；在40～50Hz的条件下，研磨3～5min；然后在冰水浴中超声4～6min；重复研磨、冰水浴的步骤3次，再低温静置20～40min，高速离心取上清液，获得含有内标物的待测样品。 3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述提取液为甲醇、乙腈和水的混合液；优选的，所述提取液为体积比为2.5～3.5:1.5～2.5:1的甲醇、乙腈和水。 4.根据权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于，所述UHPLC检测采用WatersUPLC HSS T3色谱柱；正离子模式下，流动相A：0.1％甲酸水溶液；流动相B：乙腈；负离子模式下，流动相A：5mmol/L乙酸铵水溶液；流动相B：乙腈；按如下条件进行梯度洗脱：优选的，进样量为4～6μL，柱温为28～32℃。 5.根据权利要求1～4任一项所述的方法，其特征在于，所述质谱检测的条件为：和/或，喷雾电压：3.5～4.0kV ESI 和/或，毛细管温度：300～340℃ 和/或，鞘气流速：43～47Arb 和/或，辅气流速：13～17Arb 和/或，质量范围：70-1000m/z 和/或，全扫描分辨率：65000～75000 和/或，二级扫描分辨率：15000～20000 和/或，TopN：3 和/或，碰撞能量：20,40,60 优选的，所述质谱检测的条件为：和/或，喷雾电压：3.8kV ESI 和/或，毛细管温度：320℃ 和/或，鞘气流速：45Arb 和/或，辅气流速：15Arb 和/或，质量范围：70-1000m/z 和/或，全扫描分辨率：70000 和/或，二级扫描分辨率：17500 和/或，TopN：3 和/或，碰撞能量：20,40,60。 6.根据权利要求1～5任一项所述的方法，其特征在于，所述质谱检测过程中还包括校验，所述校验具体为：将所述待测样品的混合物作为QC样，先将所述QC样进样一次，然后每分析3～6个待测样品后，再将所述QC样进样一次。 7.根据权利要求1～6任一项所述的方法，其特征在于，步骤3)中所述提取具体为：采用LC-MS数据处理软件XCMS对步骤2)所获得的代谢物原始谱图信息进行保留时间矫正、峰识别、峰提取、峰积分、峰对齐处理。 8.根据权利要求1～7任一项所述的方法，其特征在于，卡值标准为T检验的P值小于0.05，并且OPLS-DA模型第一主成分的变量投影重要度大于1的化合物为转基因玉米和非转基因玉米的差异代谢物。 9.根据权利要求1～8任一项所述的方法，其特征在于，包括如下步骤： 1)取转双斑萤叶甲MhSnf7基因玉米和非转基因玉米的5～6叶期的玉米嫩叶，采用液氮，研磨至碎末状，获得碎末样品；将所述碎末样品加入提取液中，并加入内标物；在40～50Hz的条件下，研磨3～5min；然后在冰水浴中超声4～6min；重复研磨、冰水浴的步骤3次，再低温静置20～40min，高速离心取上清液，获得含有内标物的待测样品；其中，所述提取液为体积比为2.5～3.5:1.5～2.5:1的甲醇、乙腈和水； 2)将所述待测样品进行UHPLC分离和Q Exactive Orbitrap质谱检测，获得所述转基因玉米和非转基因玉米的代谢物原始谱图信息；其中，所述UHPLC检测采用Waters UPLC HSS T3色谱柱；进样量为4～6μL，柱温为28～32℃ 正离子模式下，流动相A：0.1％甲酸水溶液；流动相B：乙腈；负离子模式下，流动相A：5mmol/L乙酸铵水溶液；流动相B：乙腈；按如下条件进行梯度洗脱：所述质谱检测的条件为：喷雾电压：3.8kV ESI 毛细管温度：320℃ 鞘气流速：45Arb 辅气流速：15Arb 质量范围：70-1000m/z 全扫描分辨率：70000 二级扫描分辨率：17500 TopN：3 碰撞能量：20,40,60；所述质谱检测过程中，将所述待测样品的混合物作为QC样，先将所述QC样进样一次，然后每分析3～6个待测样品后，再将所述QC样进样一次； 3)采用LC-MS数据处理软件XCMS对步骤2)所获得的代谢物原始谱图信息进行保留时间矫正、峰识别、峰提取、峰积分、峰对齐处理；然后再采用正交偏最小二乘法-判别分析的统计方法进行分析，获得代谢指纹数据； 4)根据步骤3)获得代理指纹数据进行建模，获得OPLS-DA模型； 5)根据所述OPLS-DA模型，卡值标准为T检验的P值小于0.05，并且OPLS-DA模型第一主成分的变量投影重要度大于1的化合物为转基因玉米和非转基因玉米的差异代谢物。 10.根据权利要求1～9任一项所述方法在转基因玉米安全评价中的应用；优选的，转基因玉米为转双斑萤叶甲MhSnf7基因玉米。
所属类别：	发明专利