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原文传递基于GC-MS获取转基因和非转基因玉米代谢差异的方法

专利名称：	基于GC-MS获取转基因和非转基因玉米代谢差异的方法
摘要：	本发明涉及基于GC‑MS获取转基因和非转基因玉米代谢差异的方法；所述方法基于气相色谱‑高分辨率质谱联用系统进行玉米叶片代谢轮廓分析，然后用多变量统计方法区分转基因和非转基因玉米数据，并对转基因和非转基因玉米叶片代谢差异进行研究的方法，获取对代谢表型差异有重要贡献的化合物。所述方法更适合快速色谱分析，可以快速可靠地识别、定量和确认更多化合物；更重要的是，其检测分辨率高，保证谱峰扫描点的完整性，不遗漏任何细节，实现高效可靠的代谢物信息识别，得到的结果更真实可靠。所述方法可以为深入研究转基因玉米的安全性提供根据。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	黑龙江;23
申请人：	黑龙江省农业科学院农产品质量安全研究所
发明人：	张晓磊;金海涛;赵琳;温洪涛;张瑞英;关海涛;张爱红;李亮;刘刚;丁一佳;杨洋
专利状态：	有效
申请日期：	2019-02-21T00:00:00+0800
发布日期：	2019-04-30T00:00:00+0800
申请号：	CN201910130545.7
公开号：	CN109696511A
代理机构：	北京路浩知识产权代理有限公司
代理人：	王文君;陈征
分类号：	G01N30/88(2006.01);G;G01;G01N;G01N30
申请人地址：	150086 黑龙江省哈尔滨市学府路368号创新大厦10楼
主权项：	1.一种基于GC-MS获取转基因和非转基因玉米代谢差异的方法，其特征在于，包括如下步骤： 1)取转基因玉米和非转基因玉米叶片，粉碎至碎末状，然后进行提取，并加入内标物，获得含有内标物的待测样品； 2)将所述待测样品进行GC-MS检测，获得所述转基因玉米和非转基因玉米的代谢物原始谱图信息； 3)采用LC-MS数据处理软件对步骤2)所获得的代谢物原始谱图信息进行提取，然后再采用正交偏最小二乘法-判别分析的统计方法进行分析，获得代谢指纹数据； 4)根据步骤3)获得代理指纹数据进行建模，获得OPLS-DA模型； 5)根据所述OPLS-DA模型，获得转基因和非转基因玉米的差异代谢物。 2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)具体为：取5～6叶期的玉米嫩叶，采用液氮，研磨至碎末状，获得碎末样品；将所述碎末样品加入提取液中，并加入内标物；在40～50Hz的条件下，研磨3～5min；然后在冰水浴中超声4～6min；重复研磨、冰水浴的步骤3次，再低温静置20～40min，高速离心取下层沉淀，干燥处理，然后再进行孵育处理，获得含有内标物的待测样品。 3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述提取液为甲醇和水的混合物；优选的，所述提取液为体积比为3.5～4.5:1的甲醇和水。 4.根据权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于，所述内标物为质量比为1:1.5～2.5核糖醇和L-2-氯苯丙氨酸。 5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述孵育处理具体为：在干燥后的样品中加入甲氧胺盐试剂，孵育25～35min，然后再加入含有0.8～1.2％三甲基氯硅烷的N,O-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺，在60～80℃的温度下，孵育1～2小时，离心，取上清液。 6.根据权利要求1～5任一项所述的方法，其特征在于，所述GC-MS检测的条件具体为： (1)毛细管柱：Agilent DB-5MS； (2)进样量0.8～1.2μL； (3)GC-MS检测参数如下：分流模式：Splitless Mode 和/或，隔垫吹扫流速：2.5～3.5mL/min 和/或，载气：Helium 和/或，柱流速：0.8～1.2mL/min 和/或，柱箱升温程序：50℃(1min)-310℃(8～12℃/min)，6～10min 和/或，前进样口温度：270～290℃ 和/或，传输线温度：270～290℃ 和/或，离子源温度：240～260℃ 和/或，电离电压：-65～-75eV 和/或，质量范围：m/z:50-500 和/或，扫描速率：18～22spectra per second 和/或，溶剂延迟时间：6～6.5min；优选的，所述GC-MS检测参数如下：分流模式：Splitless Mode 和/或，隔垫吹扫流速：3mL/min 和/或，载气：Helium 和/或，柱流速：1mL/min 和/或，柱箱升温程序：50℃(1min)-310℃(10℃/min)，8min 和/或，前进样口温度：280℃ 和/或，传输线温度：280℃ 和/或，离子源温度：250℃ 和/或，电离电压：-70eV 和/或，质量范围：m/z:50-500 和/或，扫描速率：20spectra per second 和/或，溶剂延迟时间：6.27min 更优选的，质谱检测过程中还包括校验，所述校验具体为：将所述待测样品的混合物作为QC样，先将所述QC样进样一次，然后每分析3～6个待测样品后，再将所述QC样进样一次。 7.根据权利要求1～6任一项所述的方法，其特征在于，步骤3)中所述校验具体为：采用LC-MS数据处理软件XCMS对步骤2)所获得的代谢物原始谱图信息，进行保留时间矫正、峰识别、峰提取、峰积分、峰对齐处理。 8.根据权利要求1～7任一项所述的方法，其特征在于，所述OPLS-DA中，卡值标准为T检验的P值小于0.05，并且OPLS-DA模型第一主成分的变量投影重要度大于1的化合物为转基因玉米和非转基因玉米的差异代谢物。 9.根据权利要求1～8任一项所述的方法，其特征在于，包括如下步骤： 1)取5～6叶期的玉米嫩叶，采用液氮，研磨至碎末状，获得碎末样品；将所述碎末样品加入提取液中，并加入内标物；在40～50Hz的条件下，研磨3～5min；然后在冰水浴中超声4～6min；重复研磨、冰水浴的步骤3次，再低温静置20～40min，高速离心取下层沉淀，干燥处理，在样品中加入甲氧胺盐试剂，孵育25～35min，然后再加入含有0.8～1.2％三甲基氯硅烷的N,O-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺，在60～80℃的温度下，孵育1～2小时，离心，取上清液，获得含有内标物的待测样品；其中，所述提取液为体积比为3.5～4.5:1的甲醇和水；所述内标物为质量比为1:1.5～2.5核糖醇和L-2-氯苯丙氨酸； 2)将所述待测样品进行GC-MS检测，获得所述转基因玉米和非转基因玉米的代谢物原始谱图信息；其中，所述GC-MS检测的条件具体为： (1)毛细管柱：Agilent DB-5MS； (2)进样量0.8～1.2μL； (3)GC-MS检测参数如下：分流模式：Splitless Mode 隔垫吹扫流速：3mL/min 载气：Helium 柱流速：1mL/min 柱箱升温程序：50℃(1min)-310℃(10℃/min)，8min 前进样口温度：280℃ 传输线温度：280℃ 离子源温度：250℃ 电离电压：-70eV 质量范围：m/z:50-500 扫描速率：20spectra per second 溶剂延迟时间：6.27min 优选的，质谱检测过程中还包括校验，所述校验具体为：将所述待测样品的混合物作为QC样，先将所述QC样进样一次，然后每分析3～6个待测样品后，再将所述QC样进样一次； 3)采用LC-MS数据处理软件XCMS对步骤2)所获得的代谢物原始谱图信息进行保留时间矫正、峰识别、峰提取、峰积分、峰对齐处理；然后再采用正交偏最小二乘法-判别分析的统计方法进行分析，获得代谢指纹数据； 4)根据步骤3)获得代理指纹数据进行建模，获得OPLS-DA模型； 5)根据所述OPLS-DA模型，卡值标准为T检验的P值小于0.05，并且OPLS-DA模型第一主成分的变量投影重要度大于1的化合物为转基因玉米和非转基因玉米的差异代谢物。 10.根据权利要求1～9任一项所述方法在转基因玉米安全评价中的应用；优选的，转基因玉米为转双斑萤叶甲MhSnf7基因玉米。
所属类别：	发明专利