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原文传递一种半乳糖神经酰胺转移酶抑制剂药物的快速筛选方法

专利名称：	一种半乳糖神经酰胺转移酶抑制剂药物的快速筛选方法
摘要：	本发明涉及一种半乳糖神经酰胺转移酶抑制剂药物的快速筛选方法，包括以下步骤：(1)人工合成人类的半乳糖神经酰胺转移酶的核醣核酸，然后将半乳糖神经酰胺转移酶的核醣核酸转建构在哺乳细胞表达载体pDNA3.1(+)上，得到人类半乳糖神经酰胺转移酶过表达载体；(2)将人类半乳糖神经酰胺转移酶过表达载体在非人源细胞上进行细胞转染，然后进行裂解细胞并提取细胞裂解蛋白；(3)将提取获得的细胞裂解蛋白以及反应底物置于反应缓冲液中，加入待筛选的半乳糖神经酰胺转移酶抑制剂药物，进行反应后，检测底物及反应产物的含量，然后确定待筛选的半乳糖神经酰胺转移酶抑制剂药物的抑制效果。与现有技术相比，本发明建立了快速且稳定的筛选方式。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	上海;31
申请人：	辉源生物科技(上海)有限公司
发明人：	白艳秋;吴治昊;王朝弘;刘豫屏
专利状态：	有效
申请日期：	2018-12-29T00:00:00+0800
发布日期：	2019-05-03T00:00:00+0800
申请号：	CN201811635607.1
公开号：	CN109709202A
代理机构：	上海科盛知识产权代理有限公司
代理人：	赵志远
分类号：	G01N27/62(2006.01);G;G01;G01N;G01N27
申请人地址：	201203 上海市浦东新区张江高科技园区哈雷路1011号
主权项：	1.一种半乳糖神经酰胺转移酶抑制剂药物的快速筛选方法，其特征在于，包括以下步骤： (1)人工合成人类的半乳糖神经酰胺转移酶的核醣核酸，然后将半乳糖神经酰胺转移酶的核醣核酸转建构在哺乳细胞表达载体pDNA3.1(+)上，得到人类半乳糖神经酰胺转移酶过表达载体； (2)将步骤(1)制备得到的人类半乳糖神经酰胺转移酶过表达载体在非人源细胞上进行细胞转染，然后进行裂解细胞并提取细胞裂解蛋白； (3)将提取获得的细胞裂解蛋白以及反应底物置于反应缓冲液中，加入待筛选的半乳糖神经酰胺转移酶抑制剂药物，进行反应后，检测底物及反应产物的含量，然后确定待筛选的半乳糖神经酰胺转移酶抑制剂药物的抑制效果。 2.根据权利要求1所述的一种半乳糖神经酰胺转移酶抑制剂药物的快速筛选方法，其特征在于，所述的非人源细胞选自仓鼠卵巢细胞。 3.根据权利要求1所述的一种半乳糖神经酰胺转移酶抑制剂药物的快速筛选方法，其特征在于，所述的缓冲液包括HEPES、二烯酰基磷酰胆碱、MgCl2、MnCl2、牛血清白蛋白、KCl、EGTA和CHAPS，其中，所述HEPES的浓度为8～12nM，所述二烯酰基磷酰胆碱的浓度为30～40μM，所述MgCl2的浓度为3～6mM，所述MnCl2的浓度为3～6mM，所述牛血清白蛋白的质量分数为0.8％～1.5％，所述KCl的浓度为12～18mM，所述EGTA的浓度为0.8～1.5mM，所述CHAPS的浓度为5～10mM。 4.根据权利要求1所述的一种半乳糖神经酰胺转移酶抑制剂药物的快速筛选方法，其特征在于，所述的底物包括神经酰胺和二磷酸尿苷半乳糖，所述神经酰胺和二磷酸尿苷半乳糖的质量比为(1.6～1.8):1。 5.根据权利要求4所述的一种半乳糖神经酰胺转移酶抑制剂药物的快速筛选方法，其特征在于，所述神经酰胺为带有C6-NBD标记的神经酰胺。 6.根据权利要求5所述的一种半乳糖神经酰胺转移酶抑制剂药物的快速筛选方法，其特征在于，所述底物及反应产物的含量通过RapidFire高通量质谱系统读取得到。 7.根据权利要求1所述的一种半乳糖神经酰胺转移酶抑制剂药物的快速筛选方法，其特征在于，所述细胞裂解蛋白、缓冲液、底物及待筛选的半乳糖神经酰胺转移酶抑制剂药物的加入量分别为：细胞裂解蛋白的质量为3～5μg,神经酰胺的浓度为8～12μM,二磷酸尿苷半乳糖的浓度为15～20μM，待筛选的半乳糖神经酰胺转移酶抑制剂药物的浓度为0.001μM～50μM，缓冲液使整个反应体系达到20μL。 8.根据权利要求1所述的一种半乳糖神经酰胺转移酶抑制剂药物的快速筛选方法，其特征在于，所述反应的温度为35～40℃，反应时间为0.5～2h。
所属类别：	发明专利