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原文传递一种高灵敏的磁珠分选联合胶体金标记的外泌体免疫电镜方法

专利名称：	一种高灵敏的磁珠分选联合胶体金标记的外泌体免疫电镜方法
摘要：	本发明涉及一种高灵敏的磁珠分选联合胶体金标记的外泌体免疫电镜方法，具体包括以下步骤：(1)制备生物素化的抗体；(2)纯化目标亚型外泌体；(3)免疫标记。与现有技术相比，本发明克服了目前免疫电镜技术检测外泌体时纯度低、效率低的弊端，保留了其分辨率高的优势，适合检测位于生物医学标本来源外泌体的微量抗原的检测，阳性信号得率高，便于判断。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	上海;31
申请人：	复旦大学附属华山医院
发明人：	董强;崔梅;国敏;陈兴栋;赵鸿琛;丁梦媛
专利状态：	有效
申请日期：	2019-01-14T00:00:00+0800
发布日期：	2019-05-10T00:00:00+0800
申请号：	CN201910032544.9
公开号：	CN109738630A
代理机构：	上海科盛知识产权代理有限公司
代理人：	林君如
分类号：	G01N33/532(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	200040 上海市静安区乌鲁木齐中路12号
主权项：	1.一种高灵敏的磁珠分选联合胶体金标记的外泌体免疫电镜方法，其特征在于，包括以下步骤： (1)制备生物素化的一抗：用碱性缓冲溶液将生物素化的蛋白质稀释并充分透析，得到蛋白质溶液，向蛋白质溶液中加入N-羟基琥珀酰亚胺生物素的二甲亚砜溶液，搅拌，然后加入NH4Cl溶液，搅拌、透析、洗脱后收集得到的生物素化的一抗样品； (2)纯化目标亚型外泌体：将生物样本离心分离，加入步骤(1)得到的生物素化的一抗孵育，然后与亲水性链霉素亲和磁珠混合孵育，磁分离，洗涤后再加入解离液孵育，磁分离后收集上清液，即得到纯化的目标亚型外泌体； (3)免疫标记：将步骤(2)中得到的外泌体重悬，然后将外泌体滴于parafilm膜上，将铜网置于液滴上漂浮，然后将铜网转移至PBS和NH4Cl液滴中处理，然后转移至一抗孵育、洗涤，然后转移至胶体金二抗，洗涤，用磷钨酸复染，干燥后，得到待检测的标记外泌体。 2.根据权利要求1所述的一种高灵敏的磁珠分选联合胶体金标记的外泌体免疫电镜方法，其特征在于，步骤(1)中所述的碱性缓冲溶液为0.1mol/L碳酸氢钠缓冲液或0.5mol/L硼酸缓冲液。 3.根据权利要求1所述的一种高灵敏的磁珠分选联合胶体金标记的外泌体免疫电镜方法，其特征在于，步骤(1)中：所述蛋白质溶液的浓度为1mg/mL。 4.根据权利要求1所述的一种高灵敏的磁珠分选联合胶体金标记的外泌体免疫电镜方法，其特征在于，步骤(1)中：N-羟基琥珀酰亚胺生物素的二甲亚砜溶液中每1mg N-羟基琥珀酰亚胺生物素溶于1mL二甲亚砜中，每1mL蛋白质溶液加入120μL的N-羟基琥珀酰亚胺生物素的二甲亚砜溶液。 5.根据权利要求1所述的一种高灵敏的磁珠分选联合胶体金标记的外泌体免疫电镜方法，其特征在于，步骤(1)中：NH4Cl溶液浓度为1mol/L，每25μg N-羟基琥珀酰亚胺生物素加1μL NH4Cl溶液。 6.根据权利要求1所述的一种高灵敏的磁珠分选联合胶体金标记的外泌体免疫电镜方法，其特征在于，步骤(1)中：透析在4℃下，采用磷酸盐缓冲液；洗脱时使用1mL的分子筛柱，以磷酸盐缓冲液缓慢洗脱。 7.根据权利要求1所述的一种高灵敏的磁珠分选联合胶体金标记的外泌体免疫电镜方法，其特征在于，步骤(2)中：每1mg链霉素亲和磁珠加入5-10μg一抗样品。 8.根据权利要求1所述的一种高灵敏的磁珠分选联合胶体金标记的外泌体免疫电镜方法，其特征在于，步骤(2)中：解离液为2％SDS+100mM DTT。 9.根据权利要求1所述的一种高灵敏的磁珠分选联合胶体金标记的外泌体免疫电镜方法，其特征在于，步骤(3)中：复染的磷钨酸的浓度为2％，洗涤采用磷酸盐缓冲液。 10.根据权利要求1所述的一种高灵敏的磁珠分选联合胶体金标记的外泌体免疫电镜方法，其特征在于，步骤(3)中：所述胶体金二抗采用磷酸盐缓冲液稀释，胶体金二抗和磷酸盐缓冲液的体积比为1:1000。
所属类别：	发明专利