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原文传递一种检测黄曲霉毒素B1的试剂盒及其制备方法

专利名称：	一种检测黄曲霉毒素B1的试剂盒及其制备方法
摘要：	本发明公开了一种检测黄曲霉毒素B1的试剂盒及其制备方法，涉及化学测试分析技术领域。试剂盒的制备方法，包括制备铂金二氧化硅纳米微球信号标签和四氧化三铁纳米微球捕获剂；再将制备好的上述试剂混合放入玻璃容器中，然后超声，再加热；将反应所得的产物反复用磁场清洗，分散到水中；再将反应所得的产物溶液滴入反应板的各个反应孔内，则得到检测食品中黄曲霉素B1的试剂盒。本发明中铂金二氧化硅纳米微球的引入在很大程度上解决了自然酶存在分离纯化难、合成成本高、耐酸碱性差等缺点。本发明中适配体的对于小分子的结合力强，空间位阻小，很适合对小分子进行检测。本发明中采用磁力吸附可以提高ELISA的检测性能。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	湖北;42
申请人：	湖北工业大学
发明人：	吴龙;陈小强;徐歆;祝琳
专利状态：	有效
申请日期：	2019-01-15T00:00:00+0800
发布日期：	2019-05-10T00:00:00+0800
申请号：	CN201910037553.7
公开号：	CN109738635A
代理机构：	上海硕力知识产权代理事务所(普通合伙)
代理人：	郭桂峰
分类号：	G01N33/543(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	430068 湖北省武汉市洪山区南李路28号
主权项：	1.一种用于检测食品中黄曲霉素B1的试剂盒的制备方法，其特征在于，包括：步骤1、制备铂金二氧化硅纳米微球信号标签和四氧化三铁纳米微球捕获剂；步骤2、将步骤1制备好的所述铂金二氧化硅纳米微球信号标签与所述四氧化三铁纳米微球捕获剂混合放入玻璃容器中，然后超声、加热得到产物；步骤3、将步骤2所制备的产物反复用磁场清洗，分散到水中得到产物溶液；步骤4、再将步骤3所制备的产物溶液滴入反应板的各个反应孔内，则得到检测食品中黄曲霉素B1的试剂盒。 2.如权利要求1所述的检测食品中黄曲霉素B1的试剂盒的制备方法，其特征在于，所述步骤2具体包括：所述的将步骤1制备好的所述铂金二氧化硅纳米微球信号标签与所述四氧化三铁纳米微球捕获剂混合放入玻璃容器中反应的时间至少为20min；所述的超声的时间为5min，所述的加热的条件为95℃以上持续10min；所述的铂金二氧化硅纳米微球信号标签的粒径为40nm～900nm；所述的四氧化三铁纳米微球捕获剂的粒径为80nm～900nm；所述铂金二氧化硅纳米微球信号标签和所述四氧化三铁纳米微球捕获剂的体积比为1：1。 3.如权利要求2所述的检测食品中黄曲霉素B1的试剂盒的制备方法，其特征在于，所述步骤2中：所述的将步骤1制备好的所述铂金二氧化硅纳米微球信号标签与所述四氧化三铁纳米微球捕获剂混合放入玻璃容器中反应的时间为20min；所述的铂金二氧化硅纳米微球信号标签的粒径为900nm；所述的四氧化三铁纳米微球捕获剂的粒径为400nm。 4.如权利要求1所述的用于检测食品中黄曲霉素B1的试剂盒的制备方法，其特征在于，制备所述铂金二氧化硅纳米微球信号标签具体包括以下步骤：步骤A1、将四氯金酸和柠檬酸三钠用去离子水定容后加入硼氢化钠溶液搅拌后获得金纳米粒子，将所述金纳米粒子离心洗涤后分散在水中，得到金纳米粒子溶液；步骤A2、将三乙胺加入水搅拌后，加入十六烷基三甲基溴化铵、水杨酸，正硅酸乙酯反应后，再加入盐酸甲醇溶液反应，取以上配置而成的部分溶液加入3-氨丙基三乙氧基硅烷，搅拌后得到氨基化二氧化硅纳米微球，将所述氨基化二氧化硅纳米微球离心清洗取沉淀后分散在水中，得到氨基化二氧化硅纳米微球溶液；步骤A3、将所述氨基化二氧化硅纳米微球加入所述金纳米粒子溶液，超声搅拌反应，得到红色的金二氧化硅纳米微球；步骤A4、将所述红色的金二氧化硅纳米微球离心洗涤后分散在水中，得到红色的金二氧化硅纳米微球溶液，在所述红色的金二氧化硅纳米微球溶液中加入氯铂酸后搅拌再加入硼氢化钠溶液反应，获得铂金二氧化硅纳米微球，分散到水中，得到铂金二氧化硅纳米微球溶液；步骤A5、取戊二醛原液加入到所述铂金二氧化硅纳米微球溶液孵育，将反应所得的溶液离心洗涤，分散到水中，得到戊二醛修饰过的铂金二氧化硅纳米微球溶液，再加入氨基化修饰的适配体DNA互补链并搅拌，获得所述铂金二氧化硅纳米微球信号标签。 5.如权利要求4所述的用于检测食品中黄曲霉素B1的试剂盒的制备方法，其特征在于，制备所述铂金二氧化硅纳米微球信号标签具体包括：在所述步骤A1中，所述的将四氯金酸和柠檬酸三钠用去离子水定容后所得的溶液中，四氯金酸的浓度为2.5ⅹ10-2mmol/L，柠檬酸三钠的浓度为73.5mg/L；所述的加入硼氢化钠溶液与所述的将四氯金酸和柠檬酸三钠用去离子水定容后所得的溶液与硼氢化钠溶液的体积比为3：100，并且该溶液中硼氢化钠的浓度为3ⅹ10-3mol/L，所述的搅拌时间为10～15min；所述的金纳米粒子溶液的浓度为4～4.9mg/L；在所述步骤A2中，所述的将三乙胺加入水，所得的三乙胺水溶液浓度为2.7～2.76g/L，所述的加入十六烷基三甲基溴化铵、水杨酸与三乙胺的质量比为8：1～4：1.4～1.5，正硅酸乙酯、盐酸甲醇溶液、乙醇与三乙胺水溶液的体积比为4：25：4：25；所述的以上配置而成的部分溶液与3-氨丙基三乙氧基硅烷的体积比为120：1，所述的在室温下搅拌的时间为5～6h；其中，所述的将三乙胺加入水搅拌为磁力搅拌，温度为80℃，时间至少为0.5h；所述的加入十六烷基三甲基溴化铵、水杨酸，正硅酸乙酯反应温度为80℃，时间至少为1h；所述的盐酸甲醇溶液中盐酸：甲醇体积比为1：9～11，所述的加入盐酸甲醇溶液的反应温度为60～80℃；所述的氨基化二氧化硅纳米微球溶液的浓度为86～100mg/L；在所述步骤A3中，氨基化二氧化硅纳米微球与所述金纳米粒子溶液体积比小于1：5；所述超声搅拌反应时间至少为10min；在所述步骤A4中，所述的红色的金二氧化硅纳米微球溶液的浓度为19.4mg/L，所述的在所述红色的金二氧化硅纳米微球溶液溶液中加入氯铂酸后所得到的溶液中，氯铂酸的浓度为0.47mol/L，所述的加入硼氢化钠溶液后所得的溶液中，硼氢化钠的浓度为4.8ⅹ10-5mol/L，所述铂金二氧化硅纳米微球溶液的浓度为18.2～31.2mg/L；所述的加入氯铂酸搅拌的时间至少为10min；在所述步骤A5中，戊二醛原液和所述铂金二氧化硅纳米微球溶液体积比为1：5；所述的取戊二醛原液加入到所述铂金二氧化硅纳米微球溶液中并在室温下孵育时间至少为30min；所述的戊二醛修饰过的铂金二氧化硅纳米微球溶液再加入氨基化修饰的适配体DNA互补链后所得到的溶液中，所述氨基化修饰的适配体DNA互补链的浓度为0.46～0.60nmol/mL；所述的加入氨基化修饰的适配体DNA互补链并在室温下搅拌反应时间至少为30min；所述铂金二氧化硅纳米微球信号标签的浓度为0.19～0.30mg/L。 6.如权利要求1所述的用于检测食品中黄曲霉素B1的试剂盒的制备方法，其特征在于，制备所述四氧化三铁纳米微球捕获剂具体包括以下步骤：步骤B、取戊二醛原液加入到四氧化三铁纳米微球溶液中并在室温下孵育；反应所得的戊二醛修饰过的四氧化三铁纳米微球溶液离心洗涤，分散到水中；加入氨基化修饰的适配体DNA链并在室温下搅拌反应，得到的溶液用磁场洗涤获得四氧化三铁纳米微球捕获剂。 7.如权利要求6所述的用于检测食品中黄曲霉素B1的试剂盒的制备方法，其特征在于，制备所述四氧化三铁纳米微球捕获剂具体包括：在所述步骤B中，所述的四氧化三铁纳米微球溶液浓度为10-9mol/L；所述的取戊二醛原液加入到四氧化三铁纳米微球溶液中并在室温下孵育时间至少为30min；戊二醛原液与四氧化三铁纳米微球溶液的体积比为1：5；所述的加入氨基化修饰的适配体DNA链并在室温下搅拌反应时间至少为30min；所述的反应所得的戊二醛修饰过的四氧化三铁纳米微球溶液离心洗涤，分散到水中；加入氨基化修饰的适配体DNA链后所得到的溶液中，所述氨基化修饰的适配体DNA链的浓度为2.45nmol/ml；所述四氧化三铁纳米微球捕获剂的浓度为1～1.6ⅹ10-9mol/L。 8.一种检测食品中黄曲霉素B1的试剂盒，其特征在于，由权利要求1-7任意一项所述的用于检测食品中黄曲霉素B1的试剂盒的制备方法制备而成，还包括；反应板，板体上开设多个大小相同的孔，纵向或者横向相邻两个孔的距离均相同；所述反应板的孔中存放的试剂为铂金二氧化硅纳米微球信号标签和四氧化三铁纳米微球捕获剂的产物溶液。 9.如权利要求8所述的一种检测食品中黄曲霉素B1的试剂盒，其特征在于：所述反应板的底部装配一个可自动拆卸的盒子，所述盒子的内衬大小为与所述反应板的大小相同；在所述盒子内放置同样规格大小的磁铁。 10.如权利要求8所述的一种检测食品中黄曲霉素B1的试剂盒，其特征在于：还包括：黄曲霉素标准比色卡；利用所述反应板的孔中的混合液与不同浓度的黄曲霉素B1标准溶液进行显色反应，根据显色结果制成所述黄曲霉素标准比色卡。
所属类别：	发明专利