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原文传递一种前列腺癌诊断试剂盒及制备方法与应用

专利名称：	一种前列腺癌诊断试剂盒及制备方法与应用
摘要：	本发明的试剂盒用于诊断NPM1抗体，将海肾荧光素酶基因与NPM1抗原基因重组为融合载体，利用细胞转化技术，将融合载体导入哺乳细胞系统中，进行荧光素酶‑NPM1抗原融合蛋白表达；裂解基因重组细胞，获得荧光素酶‑NPM1抗原融合蛋白，将NPM1抗原包被在96酶标板中，加入待测血清。血清中的抗体会与板上的抗原结合附在板上；加入荧光素酶‑NPM1抗原融合蛋白，通过免疫沉淀反应，使得荧光素酶‑NPM1抗原融合蛋白与患者血清中的NPM1抗体发生结合反应并吸附在板上，最终加入荧光素酶底物，检测荧光强度。根据荧光强度即可反映出NPM1抗体的含量，为前列腺癌的诊断提供参考。该方法快速简便、高灵敏度。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	浙江;33
申请人：	杭州京北生物科技有限公司
发明人：	唐东起;周扬;陈政鑫
专利状态：	有效
申请日期：	2018-12-17T00:00:00+0800
发布日期：	2019-05-17T00:00:00+0800
申请号：	CN201811546042.X
公开号：	CN109765370A
代理机构：	杭州杭诚专利事务所有限公司
代理人：	尉伟敏
分类号：	G01N33/574(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	311305 浙江省杭州市临安区青山湖科技城创业街178号
主权项：	1.一种前列腺癌诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有： 1.荧光素酶-NPM1抗原融合蛋白； 2.缓冲液I； 3.NPM1抗原包被板； 4.海肾荧光素酶底物； 5.底物缓冲液； 6.NPM1抗体阳性对照品； 7.NPM1抗体阴性对照品。 2.根据权利要求1所述的一种前列腺癌诊断试剂盒，其特征在于，所述的荧光素酶-抗体融合蛋白制备方法为：重组质粒构建：根据NPM1抗原序列，设计并合成引物，上游引物5′ CGGGGTACCCCG ATGGAAGATTCGATGGACATGGACA 3′ 下游引物5′ TGCTCTAGAGCA TCAATGCGCTTTTTCTATACTTGCT 3′；以前列腺癌患者血清为模板，扩增得到抗NPM1基因；利用kpnl和xbal在哺乳动物海肾荧光素酶表达载体pRL-null的多克隆位点上进行酶切，利用T4连接酶，将抗HCV-cAg基因连接到此位置；将重组载体转移至大肠杆菌中，通过扩繁和质粒抽提，获得重组质粒；重组蛋白表达：将10μg转染级别的重组质粒用脂质体转染试剂导入真核细胞中，37℃5％二氧化碳浓度下培养24-36小时后，利用细胞刮刀收集细胞，利用冻融破碎法裂解细胞，通过离心收获上层清液，得到荧光素酶-NPM1抗原融合蛋白。 3.根据权利要求1所述的一种前列腺癌诊断试剂盒，其特征在于，所述缓冲液I为100mMNaCl，5mM MgCl2，50mM Tris，0.05％Tween-20pH 7.5。 4.根据权利要求1所述的一种前列腺癌诊断试剂盒，其特征在于，所述的NPM1抗原包被板制作方法为：先用PBS缓冲液溶解NPM1抗原，使得其终浓度为1ug/ml，在酶标版每孔中加入200ul NPM1抗原溶液，4℃包被过夜，弃包被液，加入300ul含1％BSA的PBS溶液，室温封闭2小时；用200ul含0.1％Tween的PBS缓冲液洗涤3次，甩干板内液体。 5.一种如权利要求1所述的前列腺癌诊断试剂盒的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：荧光素酶-抗体融合蛋白制备重组质粒构建：根据NPM1抗原序列，设计并合成引物，上游引物5′ CGGGGTACCCCG ATGGAAGATTCGATGGACATGGACA 3′，下游引物5′ TGCTCTAGAGCA TCAATGCGCTTTTTCTATACTTGCT 3′；以前列腺癌患者血清为模板，扩增得到抗NPM1基因，利用kpnl和xbal在哺乳动物海肾荧光素酶表达载体pRL-null的多克隆位点上进行酶切，利用T4连接酶，将抗HCV-cAg基因连接到此位置；将重组载体转移至大肠杆菌中，通过扩繁和质粒抽提，获得大量重组质粒；重组蛋白表达：将10ug转染级别的重组质粒用脂质体转染试剂导入真核细胞中，37℃5％二氧化碳浓度下培养24-36小时后，利用细胞刮刀收集细胞，利用冻融破碎法裂解细胞，通过离心收获上层清液，得到荧光素酶-NPM1抗原融合蛋白； 2NPM1抗原包被板制作先用PBS缓冲液溶解NPM1抗原，使得其终浓度为1ug/ml，在酶标版每孔中加入200ulNPM1抗原溶液，4℃包被过夜，弃包被液，加入300ul含1％BSA的PBS溶液，室温封闭2小时；用200ul含0.1％Tween的PBS缓冲液洗涤3次，甩干板内液体。 6.一种如权利要求1所述的前列腺癌诊断试剂盒的应用，其特征在于，在包被板微孔中分别加入10ul样品血清及NPM1抗体阴性对照品与NPM1抗体阳性对照品，加入10ul的荧光素酶-NPM1抗原融合蛋白，预先条件浓度至1×107RLU/10ul，90ul缓冲液I混合，30℃300rpm震荡孵育1小时；形成NPM1抗原-NPM1抗体-荧光素酶NPM1抗原融合蛋白的复合物固定在酶标板底部；弃去孔内的液体，用200ul的PBS缓冲液洗涤5遍，甩干；洗去未结合的重组抗体融合蛋白；用底物缓冲液以1∶100稀释荧光素酶底物；在每孔中加入50ul的PBS缓冲液，50ul荧光素酶底物稀释液，立即用荧光检测仪检测荧光强度，对阴阳对照品的结果进行对比判断样品中是否含有NPM1抗体及含量。
所属类别：	发明专利