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原文传递黄曲霉毒素B1和B2磁固相萃取材料及制备方法与应用

专利名称：	黄曲霉毒素B1和B2磁固相萃取材料及制备方法与应用
摘要：	本发明提供一种黄曲霉毒素B1和B2磁固相萃取材料及制备方法与应用。所述磁固相萃取材料以超顺磁性Fe3O4@SiO2为内核，以天然亲水性琼脂糖为基质，采用复合乳化技术将琼脂糖包裹在Fe3O4@SiO2表面，然后将NHS基团修饰在琼脂糖表面，从而能够与适配体通过共价偶联的方式结合。与传统的羧基、氨基磁珠相比，表面含NHS基团的磁性琼脂糖微球无需采用1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺或戊二醛进行活化，室温下将适配体溶液与NHS磁性琼脂糖磁珠混合1～2h便可将适配体共价偶联到磁珠上。本发明的磁固相萃取材料作为一种新型磁固相萃取吸附剂将用于食品、农产品以及中药中黄曲霉毒素B1和B2的检测分析。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	北京;11
申请人：	北京农业质量标准与检测技术研究中心
发明人：	刘洪美;栾云霞;陆安祥;付海龙;郭晓军;王纪华
专利状态：	有效
申请日期：	2018-12-05T00:00:00+0800
发布日期：	2019-05-21T00:00:00+0800
申请号：	CN201811480942.9
公开号：	CN109781871A
代理机构：	北京路浩知识产权代理有限公司
代理人：	王文君;黄爽
分类号：	G01N30/02(2006.01);G;G01;G01N;G01N30
申请人地址：	100097 北京市海淀区曙光花园中路9号北京市农林科学院
主权项：	1.黄曲霉毒素B1和B2核酸适配体，其特征在于，核酸序列如SEQ ID NO:1所示。 2.权利要求1所述核酸适配体在制备用于分离黄曲霉毒素B1和B2的材料中的应用，所述材料包括磁固相萃取材料。 3.黄曲霉毒素B1和B2磁固相萃取材料，其特征在于，所述磁固相萃取材料是以Fe3O4@SiO2磁纳米颗粒为内核，外面包裹有琼脂糖，然后将NHS基团修饰在琼脂糖表面得到磁性琼脂糖微球，再将权利要求1所述核酸适配体与磁性琼脂糖微球进行共价偶联得到的。 4.根据权利要求3所述的磁固相萃取材料，其特征在于，所述核酸适配体是经过化学修饰的适配体序列，修饰方式包括氨基修饰、羧基修饰、巯基修饰或生物素修饰。 5.根据权利要求4所述的磁固相萃取材料，其特征在于，所述核酸适配体是经过氨基修饰的适配体序列，修饰方法如下：在核酸适配体的3’或5’端通过共价键连接C7间接臂-(CH2)7-或C6间接臂-(CH2)6-，然后在C7间接臂或C6间接臂的末端通过共价键修饰氨基，从而得到氨基修饰的适配体。 6.权利要求5所述磁固相萃取材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： 1)Fe3O4@SiO2磁纳米颗粒的制备将1-5g FeCl3·6H2O与6-20g醋酸钠分散至180-250mL乙二醇分析纯中，搅拌均匀投入反应釜中，200-250℃下加热10-16h，产物用磁铁收集，用水和无水乙醇反复清洗后烘干，得到Fe3O4粉末；将1-5g Fe3O4粉末分散至由200-1000mL无水乙醇和100-500mL去离子水组成的混合液中，超声分散10-30min，加入浓度为25％-28％的氨水溶液1-5mL，搅拌10-30min，然后将4-15mL正硅酸四乙酯与20-100mL无水乙醇混匀后滴加至上述溶液体系中，滴加完后于室温反应过夜，产物用磁铁收集，用水和无水乙醇反复清洗后烘干，得到Fe3O4@SiO2磁纳米颗粒； 2)磁性琼脂糖微球的制备 ①琼脂糖溶液的配制：称取1-5g琼脂糖放入烧瓶中，加热至琼脂糖完全溶解，向烧瓶中加入沸水至总体积90-200mL，摇匀后即得琼脂糖溶液； ②将1-5g Fe3O4@SiO2磁纳米颗粒分散至10-50mL去离子水中，超声10-30min，得到磁流体； ③称取12-20g Span-80溶于350-500mL液体石蜡中，在300-500rpm转速下搅拌均匀，然后加热至80℃，得到有机相； ④将②的磁流体加入到①的琼脂糖溶液中，80℃下反应30-60min，然后将此混合液加入到③的有机相中，在600-800rpm搅拌下反应1-2h，然后降温至20℃，加入1-1.5L无水乙醇进行破乳化，所得产物用去离子水和无水乙醇反复清洗，产物用磁铁收集，将产物溶于水中配制成体积百分数50-70％v/v的溶液，即得磁性琼脂糖微球； 3)NHS基团修饰的磁性琼脂糖微球的制备取步骤2)制备的磁性琼脂糖微球10-30mL，加入50-150mL 1M氢氧化钠溶液、30-90mL环氧氯丙烷和50-150mL二氧六环，升温至50-70℃反应12-16h，用去离子水和无水乙醇反复清洗，产物用磁铁收集，将产物溶于水中配制成体积百分数50-70％v/v的溶液I；取10-30mL上述溶液I，加入2-5g甘氨酸和2-5g碳酸钠，室温下反应过夜，用去离子水和无水乙醇反复清洗，产物用磁铁收集，将产物溶于水中配制成体积百分数50％v/v的溶液II；取1-5mL上述溶液II，用无水DMSO清洗，然后通过磁性分离去除磁性琼脂糖微球中的水分，加入200-500mg EDC和200-500mg NHS，混匀，45-60℃反应3-5h；产物用无水DMSO反复清洗，即得NHS基团修饰的磁性琼脂糖微球，并将NHS基团修饰的磁性琼脂糖微球溶于无水二甲基乙酰胺中，配制成体积百分数10-30％v/v的溶液III； 4)黄曲霉毒素B1和B2磁固相萃取材料的制备 ⑤取70-150uL步骤4)所得溶液III，磁性分离去除上清液； ⑥加入1-5mL无水乙醇，混合均匀，磁性分离去除上清液； ⑦重复⑥1-3次； ⑧加入核酸适配体溶液，室温振荡孵育2-5h，磁性分离除去上清液，然后加入1-5mL封闭缓冲液重悬磁珠，室温振荡孵育2-5h，磁性分离去除上清液，得到适配体功能化的磁性琼脂糖微球；其中，所述核酸适配体溶液是将1-5nmol所述核酸适配体溶于200-500μL反应缓冲液中得到的；所述反应缓冲液的配方为：0.1M MES,0.15M NaCl,pH6.0；所述封闭缓冲液的配方为：0.2％BSA,0.1M MES,0.15M NaCl,pH 6.0； ⑨将⑧的适配体功能化的磁性琼脂糖微球用清洗缓冲液反复洗涤，产物用磁铁收集；最后，将洗涤后的上述适配体功能化的磁性琼脂糖微球分散于pH 7.4的PBS中短期保存，或分散于pH 7.4的含有0.1％BSA和0.02％NaN3的PBS中长期保存；其中，所述清洗缓冲液的配方为：50mM Tris-HCl,0.15M NaCl,pH7.2。 7.权利要求1-5任一项所述磁固相萃取材料在检测、净化、富集或纯化样品中黄曲霉毒素B1和B2中的应用。 8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述样品选自粮食、饲料、奶及乳制品、水产、血液、尿液、水和中药材。 9.利用权利要求1-5任一项所述磁固相萃取材料检测样品中黄曲霉毒素B1和B2的方法，其特征在于，将样品配制成液体样本，加入到所述磁固相萃取材料中，混合后在外加磁场下进行磁性分离，去除上清液，然后加入甲醇溶剂进行解吸附，再通过外加磁场进行磁性分离，收集上清液，并对上清液中的目标物进行检测。 10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，采用高效液相色谱对上清液进行检测，且上清液无需进行前处理；优选地，高效液相色谱检测条件为：色谱柱为C18柱；柱温40℃；进样体积40μL；流动相为甲醇水溶液，甲醇和水的体积比为55:45；流速为0.8mL/min；荧光检测器的激发波长为360nm，发射波长为440nm。
所属类别：	发明专利