详情

原文传递一种磁微粒化学发光免疫检测CA125表面Tn抗原的试剂盒及其制备方法

专利名称：	一种磁微粒化学发光免疫检测CA125表面Tn抗原的试剂盒及其制备方法
摘要：	本发明涉及免疫检测技术领域，具体涉及一种磁微粒化学发光免疫检测CA125表面Tn抗原的试剂盒及其制备方法。该试剂盒包括偶联有CA125抗体Fab片段的磁分离试剂，含有唾液酸酶的能够识别Tn抗原的生物素‑凝集素试剂，链霉亲和素‑生物素‑碱性磷酸酶偶联试剂；磁分离试剂特异性结合CA125抗原，生物素‑凝集素可特异性识别CA125抗原表面的Tn抗原，链霉亲和素‑生物素‑碱性磷酸酶偶联试剂可特异性结合生物素‑凝集素试剂实现对检测信号的放大，唾液酸酶水解Tn抗原表面与唾液酸相连的糖苷键，释放唾液酸使Tn抗原暴露，提高检测的准确率、灵敏度和线性范围。本发明试剂盒特异性高、灵敏度好，可实现全自动化测试。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	上海;31
申请人：	复旦大学附属妇产科医院
发明人：	徐丛剑;王宜生;路晟;霍萌萌;胡春颖;张晓燕;顾建新;任士芳
专利状态：	有效
申请日期：	2019-03-11T00:00:00+0800
发布日期：	2019-05-21T00:00:00+0800
申请号：	CN201910180925.1
公开号：	CN109781986A
代理机构：	北京东方汇众知识产权代理事务所(普通合伙)
代理人：	张淑贤
分类号：	G01N33/574(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	200000 上海市黄浦区方斜路419号、沈阳路128号、大林路358号、方斜路566号
主权项：	1.一种磁微粒化学发光免疫检测CA125表面Tn抗原的试剂盒，其特征在于，包括偶联有CA125抗体Fab片段的磁分离试剂，含有唾液酸酶的能够识别Tn抗原的生物素-长柔毛野豌豆凝集素试剂，具备检测信号放大功能的链霉亲和素-生物素-碱性磷酸酶偶联试剂。 2.如权利要求1所述的磁微粒化学发光免疫检测CA125表面Tn抗原的试剂盒，其特征在于，还包括化学发光底物液、洗涤液和校准品工作液。 3.如权利要求1所述的磁微粒化学发光免疫检测CA125表面Tn抗原的试剂盒，其特征在于，所述CA125抗体为Ov185单克隆抗体；所述含有唾液酸酶的能够识别Tn抗原的生物素-长柔毛野豌豆凝集素试剂为含有唾液酸酶的能够识别Tn抗原的生物素-长柔毛野豌豆凝集素试剂。 4.如权利要求1～3任一项所述的磁微粒化学发光免疫检测CA125表面Tn抗原的试剂盒，其特征在于，所述CA125抗体Fab片段由以磁微珠为载体的固定化木瓜蛋白酶进行酶切制备而得，具体包括以下操作步骤： 1)准确量取一定质量固定化木瓜蛋白酶于一定体积的容器中，容器置于磁架，固定化木瓜蛋白酶沉淀后去除上清，使用0.01M的PBS缓冲溶液进行洗涤备用； 2)准确量取0.1-0.2倍固定化木瓜蛋白酶质量的CA125抗体，使用PD-10脱盐柱和含0.02M EDTA及0.02M半胱氨酸的0.01M PBS缓冲液对其进行脱盐处理，脱盐完成后将其稀释或浓缩为0.1-0.2倍固定化木瓜蛋白酶质量数的体积； 3)将步骤1)中备用的固定化木瓜蛋白酶溶液置于磁架，留沉淀去除上清，将步骤2)中脱盐后的CA125抗体溶液加入其中，于37℃条件下酶解3-4小时； 4)酶解结束后将步骤3)中溶液置于磁架，固定化木瓜蛋白酶沉淀后收集上清，此上清液中含CA125抗体Fab片段。 5.如权利要求4所述的磁微粒化学发光免疫检测CA125表面Tn抗原的试剂盒，其特征在于，所述以磁微珠为载体的固定化木瓜蛋白酶由以下方法制备获得：包括以下操作步骤： Ⅰ、准确量取一定质量Fe3O4纳米磁颗粒于一定体积的容器中，置于磁架，沉淀后去上清，使用0.1-0.5倍磁珠质量数的纯水洗涤两次，清洗完成后加入0.1-0.5倍磁珠质量数的0.01M PBS缓冲液，后加入0.04-0.08倍磁珠质量的木瓜蛋白酶，室温混匀1-2小时； Ⅱ、混匀结束后将磁珠溶液置于磁架，沉淀后去上清，加入0.1-0.3倍磁珠质量数的0.2mM盐酸缓冲液，室温混匀10-15分钟； Ⅲ、混匀结束后加入0.002-0.006倍磁珠质量数的0.5M pH＝7.4±0.1的HEPES缓冲液，调整pH至7.3±0.1，37℃混匀1-2小时； Ⅳ、混匀结束后加入1.5-4.5倍磁珠质量的甘氨酸，37℃混匀0.5-1小时； Ⅴ、混匀结束后将磁珠溶液置于磁架，沉淀后去上清，使用0.1-0.3倍磁珠质量数的3MpH＝8.6±0.1的NaHCO3缓冲液，洗涤两次； Ⅵ、洗涤完成后，将磁珠溶液置于磁架，沉淀后去上清，加入0.1-0.3倍磁珠质量数的磁珠保存液，于2～8℃进行保存。 6.如权利要求3所述的磁微粒化学发光免疫检测CA125表面Tn抗原的试剂盒，其特征在于，所述偶联有CA125抗体Fab片段的磁分离试剂由以下方法制备获得： a：取一定量的羧基磁珠溶液于一定体积的容器中，容器置于磁架，沉淀后去上清，分别使用0.01M的NaOH溶液及预冷的纯水洗涤，清洗完成后沉淀羧基磁珠去上清，仅留羧基磁珠固体； b：准确量取1-3倍磁珠质量的硫化的氮羟基琥珀酰亚胺，加入一定体积预冷的25mMpH5.0的MES缓冲溶液，使其浓度为45mg/ml； c：准确量取2-6倍磁珠质量的碳化二亚胺盐酸盐，加入一定体积预冷的25mM pH5.0的MES缓冲溶液，使其浓度为85mg/ml； d：将b配制的硫化的氮羟基琥珀酰亚胺溶液及c配制的碳化二亚胺盐酸盐溶液加入至a中盛有羧基磁珠固体的容器中，将此羧基磁珠混悬液于2～8℃条件下混匀1-2小时，完成对羧基磁珠的活化； e：羧基磁珠活化完成后置于磁架，羧基磁珠沉淀后去上清，使用预冷的25mM pH5.0的MES缓冲溶液进行洗涤，清洗完成后沉淀羧基磁珠去上清，仅留活化的羧基磁珠固体； f：准确量取0.01-0.05倍羧基磁珠质量的CA125抗体Fab片段，使用PD-10脱盐柱和25mMpH5.0的MES缓冲溶液对其进行脱盐处理，脱盐完成后将CA125抗体Fab片段溶液稀释或浓缩为0.04-0.2倍羧基磁珠质量数的体积； g：将f中的CA125抗体Fab片段溶液加入至e中盛有经活化的羧基磁珠固体的容器中，室温混匀3-4小时，完成羧基磁珠与CA125抗体Fab片段的偶联； h：羧基磁珠与CA125抗体Fab片段偶联完成后置于磁架，羧基磁珠沉淀后去上清，加入与f中CA125抗体Fab片段溶液等体积的100mM pH7.4的Tris-盐酸溶液，室温混匀0.5-1小时对羧基磁珠剩余活化位点进行封闭； i：羧基磁珠封闭完成后置于磁架，羧基磁珠沉淀后去上清，使用0.1％PBST缓冲液进行洗涤，清洗完成后沉淀羧基磁珠去上清，加入与f中CA125抗体Fab片段溶液等体积的磁分离试剂保存缓冲液进行保存。 7.如权利要求1所述的磁微粒化学发光免疫检测CA125表面Tn抗原的试剂盒，其特征在于，所述含有唾液酸酶的能够识别Tn抗原的生物素-长柔毛野豌豆凝集素试剂由以下方法制备获得：包括准确量取一定量生物素-长柔毛野豌豆凝集素试剂，加入唾液酸酶缓冲液将其稀释至10μg/ml，即得含有唾液酸酶的生物素-长柔毛野豌豆凝集素试剂。 8.如权利要求7所述的磁微粒化学发光免疫检测CA125表面Tn抗原的试剂盒，其特征在于，所述唾液酸酶缓冲液的浓度为0.1-0.5U/ml，并由以下方法制备获得：准确量取BSA 10g、NaCl 8g、KCl 0.2g、12 H2O·Na2HPO4 3.6g、KH2PO4 0.3g、1MCaCl2 0.1ml、1U/ml唾液酸酶0.1-0.5ml，添加纯化水1L混匀30min，调节pH＝7.2±0.05，0.22μm过滤后即得。 9.如权利要求1所述的磁微粒化学发光免疫检测CA125表面Tn抗原的试剂盒，其特征在于，所述具备检测信号放大功能的链霉亲和素-生物素-碱性磷酸酶偶联试剂由以下方法制备获得： A：准确量取一定质量的碱性磷酸酶制剂，使用PD-10柱及0.1M pH＝8.4±0.05的NaHCO3缓冲液对其进行除盐，除盐结束后浓缩至浓度为3-4mg/ml，备用； B：准确量取0.08-0.16倍碱性磷酸酶质量的生物素固体粉末，溶解于二甲基亚砜，终浓度为10-15mg/ml； C：将B配制的生物素溶液加入至A中备用的碱性磷酸酶溶液，室温混匀4-5h进行偶联； D：偶联结束后使用分子筛层析法对其进行纯化，去除未偶联的生物素，得到生物素-碱性磷酸酶偶联试剂； E：准确量取7倍碱性磷酸酶质量的链霉亲和素试剂，加入D中所得的生物素-碱性磷酸酶偶联试剂，于37℃混匀20分钟，得到高浓度链霉亲和素-生物素-碱性磷酸酶偶联试剂； F：工作液缓冲液的配制：准确量取BSA 10g、NaCl 8g、KCl 0.2g、Na2HPO4·12H2O3.6g、KH2PO4 0.3g、1M CaCl2 0.1ml，添加纯化水1L混匀30min，调节pH＝7.2±0.05，0.22μm过滤后备用； G：取步骤D制备的链霉亲和素-生物素-碱性磷酸酶偶联试剂加入步骤F制备的工作液缓冲液稀释至30ug/ml，即得所述链霉亲和素-生物素-碱性磷酸酶偶联试剂。 10.一种如权利要求2所述的磁微粒化学发光免疫检测CA125表面Tn抗原的试剂盒的制备方法，其特征在于，包括分别制备偶联有CA125抗体Fab片段的磁分离试剂，含有唾液酸酶的能够识别Tn抗原的生物素-长柔毛野豌豆凝集素试剂、具备检测信号放大功能的链霉亲和素-生物素-碱性磷酸酶偶联试剂、化学发光底物液、洗涤液和校准品校准品，将制备好的各试剂组装在一个试剂盒中，即完成。
所属类别：	发明专利