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原文传递用于快速克隆T细胞受体的组合物和方法

专利名称：	用于快速克隆T细胞受体的组合物和方法
摘要：	提供了用于克隆T细胞受体(TCR)的方法、组合物、重组DNA分子和试剂盒。该方法有助于从含有抗原特异性T细胞的生物样品构建TCR表达文库，所述生物样品包括但不限于肿瘤活组织检查物，其中包括冷冻的肿瘤活组织检查物。用源自文库的TCR基因工程化的外周T细胞示出有效的治疗性抗肿瘤效果。该方法可以采用任何含有T细胞的样品进行，并且可以用寡克隆T细胞群体(如已经浸润肿瘤的T细胞)进行。提供了用于第一链cDNA合成、第二链cDNA合成和用于将多种不同的TCRβ链和TCRα链克隆到多种载体中的引物组合。提供了含有载体的细胞，以及用于快速克隆TCRβ链和TCRα链的试剂盒。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	美国;US
申请人：	健康研究公司
发明人：	坤勒·奥顿斯;理查德·科亚;塔克马萨·特苏基
专利状态：	有效
申请日期：	2017-08-01T00:00:00+0800
发布日期：	2019-05-24T00:00:00+0800
申请号：	CN201780059967.9
公开号：	CN109804246A
代理机构：	北京清亦华知识产权代理事务所(普通合伙)
代理人：	宋融冰
分类号：	G01N33/53(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	美国纽约
主权项：	1.一种从寡克隆T细胞群体的T细胞受体(TCR)克隆多种TCRα链和β链可变序列的方法，所述方法包括： 1)从所述寡克隆T细胞群体获得RNA，其中所述RNA包含编码TCRα链和β链可变序列的mRNA，并且从所述mRNA产生第一单链cDNA，其中所述第一单链cDNA包括编码所述TCRα链的单链cDNA和编码所述TCRβ链的单链cDNA，其中采用寡聚dT引物通过逆转录产生所述单链cDNA以获得从所述mRNA扩增的第一链cDNA的样品； 2)将1)中的所述样品分成第一样品和第二样品并且进行聚合酶链式反应(PCR)，所述反应包括：采用以下所有引物在所述第一样品中进行第二链cDNA合成以获得编码所述TCRβ链的双链cDNA扩增子，采用以下所有引物在所述第二样品中进行第二链cDNA合成以获得编码所述TCRα链的双链cDNA扩增子， 3)将所述第一样品和所述第二样品与核酸外切酶孵育一段时期，以足以降解未合并到所述扩增子的引物和可能存在的单链cDNA，随后利用热处理使所述核酸外切酶失活； 4)采用标签特异性引物 HTTCR#A-ACTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCTGCGGCCGCCACCATG(SEQ ID NO：1)和引物HTTCR#B-CTCAAACACAGCGACCTCGGGTGGGAACAC(SEQ ID NO：2)在所述第一样品中对编码TCRβ链的扩增子进行PCR扩增以获得所述编码TCRβ链的扩增子，其中所述编码TCRβ链的扩增子还包含限制性核酸内切酶识别位点、Kozak序列和翻译起始ATG序列；采用标签特异性引物HTTCR#D GGAGACGTGGAAGAAAACCCCGGTCCCATG(SEQ ID NO：48)和HT-TCR#E AGGCAGACAGACTTGTCACTGGATTTAGAG(SEQ ID NO：49)在所述第二样品中对编码TCRα链的扩增子进行PCR扩增以获得所述编码TCRα链的扩增子，其中所述包含TCRα链的扩增子还包含P2A序列和起始ATG序列；和 5)将4)中的所述编码TCRβ链的扩增子和所述编码TCRα链的扩增子组装成DNA载体，以提供多种DNA载体，每种DNA载体包含编码仅一种TCRβ链和仅一种TCRα链的DNA区段，其中所述载体包含编码TCRβ链的区段和编码TCRα链的区段之间的Cβ-2A融合区段，从而提供多种DNA载体，所述多种DNA载体中的每种载体仅编码所述寡克隆T细胞群体的所述TCR的单种TCRβ链和单种TCRα链。 2.根据权利要求1所述的方法，其中所述寡克隆T细胞群体获得自癌症肿瘤。 3.根据权利要求2所述的方法，其中所述肿瘤包括膀胱癌、脑癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、肾癌、结肠癌、胃癌、胰腺癌、前列腺癌或肝癌、骨髓瘤、肉瘤，由白血病、淋巴瘤或黑素瘤形成的肿瘤，和/或其中所述肿瘤包括表达包括以下至少一种的免疫原性肿瘤抗原的癌细胞：NY-ESO-1、WT1、MUC1、LMP2、HPV E6和E7、EGFRvIII、HER2/neu、MAGE-A3、p53、NY-ESO-1、PSMA、GD2、CEA、MalanA/MART1、突变Ras、gp100、蛋白酶3、bcr-abl、酪氨酸酶、存活素、PSA、hTERT、MAGE-A1、MAGE-A4、MAGE-C1、MAGE-C2、PLAC1、Sp17、TRP-2、周期素B1、间皮素、叶酸受体α和患者特异性新抗原。 4.根据权利要求2所述的方法，其中5)中的所述DNA载体能够在淋巴细胞中表达所述TCRα链和所述TCRβ链，使得所述淋巴细胞表现出针对由所述癌症肿瘤表达的抗原的抗原特异性。 5.根据权利要求2所述的方法，包括向淋巴细胞中引入至少一种5)中的DNA载体，并且允许由至少一种载体编码的所述TCRβ链和所述TCRα链的表达，使得所述淋巴细胞表达包含所述TCRβ链和所述TCRα链的功能性TCR。 6.根据权利要求2所述的方法，包括向淋巴细胞引入至少一种5)中的DNA载体，允许由至少一种载体编码的所述TCRβ链和所述TCRα链的表达，并且随后将包含所述至少一种DNA载体的所述淋巴细胞暴露至与所述癌症肿瘤具有相同类型癌症的癌细胞，并且确定所述淋巴细胞是否表现出针对由所述癌细胞表达的抗原的抗原特异性。 7.根据权利要求6所述的方法，包括确定所述淋巴细胞表现出针对由所述癌细胞表达的抗原的抗原特异性。 8.根据权利要求7所述的方法，其中所述癌细胞包括膀胱癌细胞、脑癌细胞、乳腺癌细胞、卵巢癌细胞、肺癌细胞、肾癌细胞、结肠癌细胞、胃癌细胞、胰腺癌细胞、前列腺癌细胞或肝癌细胞、骨髓瘤细胞、肉瘤细胞，由白血病、淋巴瘤形成的肿瘤细胞或黑素瘤细胞，和/或其中所述癌细胞表达包括以下至少一种的免疫原性肿瘤抗原：NY-ESO-1、WT1、MUC1、LMP2、HPV E6和E7、EGFRvIII、HER2/neu、MAGE-A3、p53、NY-ESO-1、PSMA、GD2、CEA、MalanA/MART1、突变Ras、gp100、蛋白酶3、bcr-abl、酪氨酸酶、存活素、PSA、hTERT、MAGE-A1、MAGE-A4、MAGE-C1、MAGE-C2、PLAC1、Sp17、TRP-2、周期素B1、间皮素、叶酸受体α或患者特异性新抗原。 9.根据权利要求1所述的方法，其中所述多种DNA载体中的至少一些DNA载体编码不被所述寡克隆T细胞群体中的任何T细胞表达的TCRβ链和TCRα链组合。 10.根据权利要求9所述的方法，还包括向淋巴细胞引入至少一种DNA载体，允许由至少一种载体编码的所述TCRβ链和所述TCRα链的表达，并且随后将包含所述至少一种DNA载体的所述淋巴细胞暴露至与所述癌症肿瘤具有相同类型癌症的癌细胞，并且确定所述淋巴细胞是否表现出针对由所述癌细胞表达的抗原的抗原特异性，并且可选地进一步确定所述淋巴细胞是否表现出针对由非癌细胞表达的抗原的抗原特异性。 11.一种淋巴细胞，包含至少一种根据权利要求1所述的方法制备的DNA载体，用于制备多种DNA载体。 12.根据权利要求11所述的淋巴细胞，其中所述淋巴细胞是CD4+淋巴细胞或CD8+淋巴细胞。 13.根据权利要求12所述的淋巴细胞，其中所述淋巴细胞的功能性TCR表达TCRβ链和TCRα链，其中所述淋巴细胞对选自以下的癌症表现出抗原特异性：膀胱癌、脑癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、肾癌、结肠癌、胃癌、胰腺癌、前列腺癌或肝癌、骨髓瘤、肉瘤，由白血病、淋巴瘤或黑素瘤形成的肿瘤。 14.根据权利要求12所述的淋巴细胞，其中所述淋巴细胞的功能性TCR表达由至少一种载体编码的TCRβ链和TCRα链，其中所述淋巴细胞对以下至少一种表现出抗原特异性：NY-ESO-1、WT1、MUC1、LMP2、HPV E6和E7、EGFRvIII、HER2/neu、MAGE-A3、p53、NY-ESO-1、PSMA、GD2、CEA、MalanA/MART1、突变Ras、gp100、蛋白酶3、bcr-abl、酪氨酸酶、存活素、PSA、hTERT、MAGE-A1、MAGE-A4、MAGE-C1、MAGE-C2、PLAC1、Sp17、TRP-2、周期素B1、间皮素、叶酸受体α或患者特异性新抗原。 15.一种试剂盒，包含以下所有引物： HTTCR#A(ACTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCTGCGGCCGCCACCATG；SEQ ID NO:1)和和 HTTCR#B(CTCAAACACAGCGACCTCGGGTGGGAACAC；SEQ ID NO:2)和和 HTTCR#D GGAGACGTGGAAGAAAACCCCGGTCCCATG(SEQ ID NO:48)和HT-TCR#E-AGGCAGACAGACTTGTCACTGGATTTAGAG(SEQ ID NO:49)。 16.根据权利要求15所述的试剂盒，还包括包含NotI和/或PspOMI限制性核酸内切酶识别序列和编码半胱氨酸修饰的Cα片段的区段的目的载体。 17.根据权利要求15所述的试剂盒，还包括用于进行第一链cDNA合成和/或用于以聚合酶链式反应(PCR)进行第二链cDNA合成的一种或多种缓冲液。 18.根据权利要求15所述的试剂盒，还包括逆转录酶和/或DNA聚合酶。 19.根据权利要求16所述的试剂盒，还包括NotI和/或PspOMI限制性核酸内切酶。 20.根据权利要求15所述的试剂盒，还包括包含NotI和/或PspOMI限制性核酸内切酶识别序列和编码半胱氨酸修饰的Cα片段的区段的目的载体、和用于进行第一链cDNA合成和第二链cDNA合成的一种或多种缓冲液、逆转录酶和DNA聚合酶及NotI和/或PspOMI限制性核酸内切酶。
所属类别：	发明专利