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原文传递基于多克隆抗体制备的HDL3免疫比浊法检测试剂盒及其制备使用方法

专利名称：	基于多克隆抗体制备的HDL3免疫比浊法检测试剂盒及其制备使用方法
摘要：	本发明提供了一种基于多克隆抗体制备的HDL3免疫比浊法检测试剂盒，包括试剂R1和试剂R2，试剂R1：Tris‑HCl、PEG 6000、BSA、NaCl、NaN3、EDTA、Polyoxyethylene styrenated phenyl ether derivative、鸡抗人HDL3多克隆抗体；试剂R2：Tris‑HCl、PEG 6000、BSA、NaCl、NaN3、EDTA、Polyoxyethylene polycyclic phenyl ether。本发明还提供了一种上述试剂盒的制备与使用方法。本发明试剂盒利用免疫比浊法测定HDL3，能直接测定HDL3含量，测试结果更可靠。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	安徽;34
申请人：	安徽大千生物工程有限公司
发明人：	符修乐
专利状态：	有效
申请日期：	2019-02-25T00:00:00+0800
发布日期：	2019-05-28T00:00:00+0800
申请号：	CN201910136064.7
公开号：	CN109813921A
代理机构：	合肥兴东知识产权代理有限公司
代理人：	王伟
分类号：	G01N33/92(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	231200 安徽省合肥市经开区桃花工业园繁华大道工投·立恒工业广场B12C
主权项：	1.一种基于多克隆抗体制备的HDL3免疫比浊法检测试剂盒，其特征在于，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，包括的成分及相应含量为：试剂R1：其溶剂为纯化水；试剂R2：其溶剂为纯化水。 2.根据权利要求1所述的基于多克隆抗体制备的HDL3免疫比浊法检测试剂盒，其特征在于，还包括HDL3校准品，包括的成分及相应含量为：其溶剂为纯化水。 3.根据权利要求1所述的基于多克隆抗体制备的HDL3免疫比浊法检测试剂盒，其特征在于，所述Polyoxyethylene styrenated phenyl ether derivative由一种或几种HBL值13.0-14.0的聚氧乙烯苯乙烯化苯基醚衍生物构成。 4.根据权利要求3所述的基于多克隆抗体制备的HDL3免疫比浊法检测试剂盒，其特征在于，所述HBL值13.0-14.0的聚氧乙烯苯乙烯化苯基醚衍生物具体为花王公司产品EMULGEN B-66、EMULGEN A-90或日光化学公司产品NIKKOL BC-10。 5.根据权利要求1所述的基于多克隆抗体制备的HDL3免疫比浊法检测试剂盒，其特征在于，所述Polyoxyethylene polycyclic phenyl ether由一种或几种HBL值15.0-15.6的聚氧乙烯多环苯基醚构成。 6.根据权利要求5所述的基于多克隆抗体制备的HDL3免疫比浊法检测试剂盒，其特征在于，所述HBL值15.0-15.6的聚氧乙烯多环苯基醚具体为日光化学公司产品NIKKOL BC-15、NIKKOL BO-15V或NIKKOL BD-10。 7.根据权利要求1所述的基于多克隆抗体制备的HDL3免疫比浊法检测试剂盒，其特征在于，所述鸡抗人HDL3多克隆抗体的获取方法如下： ①鸡的免疫：选择30日龄、体重400g以上公鸡，取1mL 2.0mg/mL HDL3抗原与等量弗氏佐剂充分匀浆形成稳定乳液，记为乳化抗原；每只鸡于脖外侧注射共2mL乳化抗原；7日后进行第二次免疫，免疫方案如前；21日后进行第三次免疫，免疫方案如前；42日后进行第四次免疫，采用翅静脉注射2mL 1.0mg/mL HDL3抗原；49日取翅静脉血分离血清，并使用琼脂双扩散法测抗体效价，测得效价1:32及以上，终止免疫；采用心脏无菌采血法获得全血； ②多克隆抗体的纯化：将上述步骤获得的全血于室温划十字口静置1h，再取上清获得粗制血清，粗制血清于4℃、1000r/min的条件下离心30min，得血清；加入等体积的PBS混匀得混合液，并向混合液中缓慢滴加同等体积的饱和硫酸铵，4℃静置5h；接着，于4℃、4500r/min条件下离心30min，弃去上清，沉淀用200mL的PBS溶解，加入总体积量33％的饱和硫酸铵，4℃下静置5h后，再于4℃、4500r/min条件下离心30min；此时，弃去上清，并将沉淀用200mL的PBS溶解，加入总体积量33％的饱和硫酸铵，4℃下静置5h后，4℃、4500r/min离心30min；离心后的沉淀再用200mL的PBS溶解，并进一步装入10kD透析袋中；最后，将其置于4℃环境下，采用20倍体积的PBS透析液透析6h除盐，即得鸡抗人HDL3多克隆抗体。 8.根据权利要求1-7任一所述的基于多克隆抗体制备的HDL3免疫比浊法检测试剂盒，其特征在于，所述HDL3的获取方法如下： ①HDL分离液的配制：称取分子量50000的硫酸葡聚糖9g、MgCl2·6H2O 105g、NaN3 250mg，并用900mL的蒸馏水溶解，然后用1mol/L的NaOH液调节pH至7.0，最后用蒸馏水加至1000mL，备用； ②HDL3分离液的配制：称取分子量50000的硫酸葡聚糖9g、MgCl2·6H2O 315g、NaN3 250mg，并用900mL蒸馏水溶解，接着用1mol/L的NaOH调节pH至7.0，最后用蒸馏水加至1000mL，备用； ③分离：吸取人血清50mL，加HDL分离液5mL，混匀；室温静置15min，然后于2000r/min条件下离心20min；取上清液20mL，并加入HDL3分离液2mL，混匀；接着，室温静置15min后，再于2000r/min条件下离心20min，此上清即为HDL3产物； ④浓度标定：用Tris-HCl缓冲液稀释HDL3产物，使用微量定量仪标定到10mg/mL，备用。 9.一种如权利要求1-8任一所述的基于多克隆抗体制备的HDL3免疫比浊法检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括如下具体步骤： (1)制备人HDL3： ①HDL分离液的配制：称取分子量50000的硫酸葡聚糖9g、MgCl2·6H2O 105g、NaN3250mg，并用900mL的蒸馏水溶解，然后用1mol/L的NaOH液调节pH至7.0，最后用蒸馏水加至1000mL，备用； ②HDL3分离液的配制：称取分子量50000的硫酸葡聚糖9g、MgCl2·6H2O 315g、NaN3250mg，并用900mL蒸馏水溶解，接着用1mol/L的NaOH调节pH至7.0，最后用蒸馏水加至1000mL，备用； ③分离：吸取人血清50mL，加HDL分离液5mL，混匀；室温静置15min，然后于2000r/min条件下离心20min；取上清液20mL，并加入HDL3分离液2mL，混匀；接着，室温静置15min后，再于2000r/min条件下离心20min，此上清即为HDL3产物； ④浓度标定：用Tris-HCl缓冲液稀释HDL3产物，使用微量定量仪标定到10mg/mL，备用； (2)制备鸡抗人HDL3多克隆抗体： ①鸡的免疫：选择30日龄、体重400g以上公鸡，取1mL 2.0mg/mL HDL3抗原与等量弗氏佐剂充分匀浆形成稳定乳液，记为乳化抗原；每只鸡于脖外侧注射共2mL乳化抗原；7日后进行第二次免疫，免疫方案如前；21日后进行第三次免疫，免疫方案如前；42日后进行第四次免疫，采用翅静脉注射2mL 1.0mg/mL HDL3抗原；49日取翅静脉血分离血清，并使用琼脂双扩散法测抗体效价，测得效价1:32及以上，终止免疫；采用心脏无菌采血法获得全血； ②多克隆抗体的纯化：将上述步骤获得的全血于室温划十字口静置1h，再取上清获得粗制血清，粗制血清于4℃、1000r/min的条件下离心30min，得血清；接着，加入等体积的PBS混匀得混合液，并向混合液中缓慢滴加同等体积的饱和硫酸铵，4℃静置5h；接着，于4℃、4500r/min条件下离心30min，弃去上清，沉淀用200mL的PBS溶解，加入总体积量33％的饱和硫酸铵，4℃下静置5h后，再于4℃、4500r/min条件离心30min；此时，弃去上清，并将沉淀用200mL的PBS溶解，加入总体积量33％的饱和硫酸铵，4℃下静置5h后，4℃、4500r/min离心30min；离心后的沉淀再用200mL的PBS溶解，并进一步装入10kD透析袋中；最后，将其置于4℃环境下，采用20倍体积的PBS透析液透析6h除盐，即得鸡抗人HDL3多克隆抗体； (3)配制试剂R1：按照试剂R1的组分含量，将步骤(2)制得的鸡抗人HDL3多克隆抗体以及余下的其他组分物质于同一容器中混合，混合均匀后，制得试剂R1； (4)配制试剂R2：按照试剂R2的组分含量，将各组分物质于同一容器中混合，混合均匀后，制得试剂R2。 10.一种如权利要求1-8任一所述的基于多克隆抗体制备的HDL3免疫比浊法检测试剂盒的使用方法，其特征在于，包括如下具体步骤： (1)吸取2μL样本，加入150μL试剂R1，37℃孵育5min； (2)再加入50μL试剂R2进行混合，并使其充分反应； (3)1min后读取吸光值A1，3min后读取吸光值A2，计算ΔA； (4)定标方法：6点定标；采用全自动生化分析仪进行检测，并设置校准品浓度分别为：0μg/mL、11.8μg/mL、46.9μg/mL、187.5μg/mL、375μg/mL、1500μg/mL； (5)依据定标值，根据ΔA测算样本中HDL3含量。
所属类别：	发明专利