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原文传递一种水果过敏原的提取鉴定及组分诊断方法

专利名称：	一种水果过敏原的提取鉴定及组分诊断方法
摘要：	本发明公开了一种水果过敏原的提取鉴定及组分诊断方法，包括以下加工步骤，S1，首先对水果蛋白进行总量提取；S2，步骤S1中的水果总蛋白含量进行测定；S3，鉴定水果蛋白不同组分；S4，鉴定水果蛋白致敏组分；S5，结果分析。本研究利用蛋白提取法、Bradford蛋白检测法、SDS‑PAGE(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)、Western‑Blot等方法，发明了一种水果过敏原提取鉴定及组分检测的实验室诊断方法，能够用于桃、樱桃、猕猴桃、石榴等不同种类水果过敏患者的体外诊断，而且能够细化至组分检测，为临床上诊断食物过敏、以及明确过敏原组分提供了新的方法，并为今后研发我国特有的水果过敏原组分检测芯片积累经验。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	山东;37
申请人：	青岛大学附属医院
发明人：	高翔;刘小梅;曲政海;管仁政;王婷
专利状态：	有效
申请日期：	2019-02-21T00:00:00+0800
发布日期：	2019-05-31T00:00:00+0800
申请号：	CN201910129289.X
公开号：	CN109828118A
代理机构：	北京科亿知识产权代理事务所(普通合伙)
代理人：	汤东凤
分类号：	G01N33/68(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	266000 山东省青岛市市南区江苏路16号
主权项：	1.一种水果过敏原的提取鉴定及组分诊断方法，其特征在于，包括以下加工步骤，S1，首先对水果蛋白进行总量提取； S2，步骤S1中的水果总蛋白含量进行测定； S3，鉴定水果蛋白不同组分； S4，鉴定水果蛋白致敏组分； S5，结果分析。 2.根据权利要求1所述的一种水果过敏原的提取鉴定及组分诊断方法，其特征在于，步骤S1中，提取方法包括，首先配制蛋白提取液：在10mmol/L磷酸盐缓冲液(PhosphateBuffered Saline,PBS)(PH 7.0)中加入2％聚乙烯聚吡咯烷酮、2mmol/L乙二胺四乙酸二钠、10mmol/L乙二基二硫代氨基甲酸酯；再制取水果蛋白浸液:取新鲜果肉及果皮，按4:1(wt/vol)加入上述蛋白提取液中，温度在4℃，持续搅拌30min，并进行离心加工，离心力设为15000g，时间控制为30min，再取上清，过0.2μm滤膜，其次进行透析：将透析袋置于沸水中5min后冷却；向透析袋内灌入水果蛋白浸液，并密封好两端，置于PBS中透析24h，透析过程应持续搅拌，每8h换透析液1次，最后进行分装冻干：将透析后的水果蛋白浸液分装至清洁的10ml玻璃小瓶内，每瓶分装2ml，放入-80℃冰箱内预冻过夜，次日使用冻干机持续冻干48h，将冻干的醇溶蛋白放入-80℃冰箱内保存待用。 3.根据权利要求1所述的一种水果过敏原的提取鉴定及组分诊断方法，其特征在于，步骤S2中，测定方法步骤包括如下，先用去离子水溶解牛血清白蛋白(BSA)，配制6个不同浓度的BSA溶液——0.5mg/ml、0.4mg/ml、0.3mg/ml、0.2mg/ml、0.1mg/ml、0.05mg/ml作为标准浓度；向1瓶该水果蛋白冻干品中加入1ml去离子水，充分震荡溶解，并以去离子水适当倍数稀释，在96孔酶标板中加入6个蛋白浓度标准、去离子水以及1-5倍数稀释后的水果蛋白复溶液，10μl/孔，以上溶液均作复孔，将染色液与去离子水按体积比1:4稀释后，向每孔中加入200μl稀释染色剂，充分振荡混匀后在室温下反应5min，用分光光度计读取595nm下的吸光度值A595nm，以各浓度BSA的吸光度值A595nm绘制标准曲线，通过线性拟合求出线性方程，代入样品吸光度值即可算出样品蛋白浓度。 4.根据权利要求1所述的一种水果过敏原的提取鉴定及组分诊断方法，其特征在于，步骤S3中，鉴定方法包括，首先组装电泳系统：取出预制聚丙烯酰胺梯度凝胶，撕掉胶盒底部胶条，置于垂直电泳槽中，充分卡牢；向电泳槽内加入电泳缓冲液，先加满内槽，再向外槽中加入没过胶盒底部封条处的缓冲液，但切勿使内外槽液面相通，待胶盒在缓冲液中浸泡数秒后，小心拔出样品梳；样品处理：取1瓶水果蛋白冻干品，加入1ml去离子水，室温下充分震荡溶解，并进行倍数稀释；取稀释后样品、4×样品缓冲液按体积比3:1混合，用涡旋振荡器充分混匀后，置于恒温金属浴中(95℃，15min)；上样：待样品充分冷却后，用微量加样器上样，Marker上样量为3μl/lane，水果蛋白上样量需参考蛋白浓度，控制在10μg左右，体积≤20μl/lane，在空白加样孔中加入等体积的样品缓冲液作为阴性对照；电泳：以200V电压持续电泳，直至染料前沿到达凝胶底部，终止电泳，整个过程持续45分钟；染色：从电泳装置上卸下胶盒，待其稍冷却后，小心撬开胶板，切去底部和上端多余部分后将胶移入足量染色液中，置于摇床上室温下平摇染色1小时；脱色：回收染色液，将凝胶浸泡于脱色液中，于摇床上平摇脱色，期间更换脱色液数次，至蛋白条带清晰，可见水果蛋白不同组分的条带。 5.根据权利要求1所述的一种水果过敏原的提取鉴定及组分诊断方法，其特征在于，步骤S4中，鉴定过敏组分方法包括， 1.1 取水果蛋白样品进行SDS-PAGE； 1.2 电转移(半干法)； SDS-PAGE后切除凝胶底部和顶端多余部分，并测量剩余胶大小，将凝胶浸入转移缓冲液(10×转移缓冲液以蒸馏水稀释)中5分钟；同时，根据剩余凝胶大小切取PVDF膜1张，并在膜上作标记以便转印后区分接触面和电泳方向，将PVDF膜置于100％甲醇中10s，充分浸透后PVDF膜由白色变为半透明状，然后置入转印缓冲液中浸透，切取同样大小滤纸6张，以转印缓冲液润湿；用蒸馏水清洗电泳转移槽，在阴极板中央依次铺上3张润湿滤纸-分离胶-PVDF膜-3张润湿滤纸，并充分对齐；电极板、滤纸、胶、PVDF膜之间不能留有任何气泡，可以使用玻璃试管轻轻碾压以除去气泡，最后用滤纸吸净电极板上多余的缓冲液，盖上阳极板，开始电转移，转移条件：恒流1.50mA/cm2×45min； 1.3 检测转移效果：待转移完毕，将PVDF膜浸入100％甲醇中振摇5min，充分润湿后再使用，以丽春红S染色3min，用蒸馏水脱色，换液数次后，大致可检测蛋白条带转移效果，将Marker切下，继续用蒸馏水脱色至染料基本脱尽，切下的Marker用氨基黑10B染色3min，回收染料后以100％甲醇脱色，换液数次即可清楚显示Marker的蛋白条带，置滤纸上自然干燥待分析； 1.4 封闭：将切除Marker后的PVDF膜浸入5％脱脂奶粉/PBST封闭液中封闭，室温×3hr； 1.5 洗涤：PBST洗涤5min×3次，期间置于摇床上平摇； 1.6 孵育一抗(血清)：阳性患者血清、健康对照血清均用封闭液1:1稀释，总体积600μl/lane，室温摇振1hr后置4℃摇振过夜(12hr)，洗涤； 1.7 孵育二抗(MAH-IgE-HRP)：二抗以封闭液1:1000稀释，500μl/lane，室温下摇振2hr，洗涤； 1.8 配制ECL显色液：充分洗涤膜HRP标记的二抗后，分别取等体积的溶液A和B(配制量100μl/lane)，混匀后使用； 1.9 显色：用镊子将PVDF膜取出，沥干洗液但勿使膜完全干燥，用微量加样器将新鲜配制的ECL显色液滴于膜上待显色区域，孵育1min后准备曝光； 1.10 曝光：将杂交膜贴于曝光板上，放在暗室内，蛋白面向上，连续曝光一段时间，如数秒到数分钟，获取图像，分析结果。
所属类别：	发明专利