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原文传递一种PEG修饰蛋白多关键参数同时检测方法

专利名称：	一种PEG修饰蛋白多关键参数同时检测方法
摘要：	本发明涉及PEG修饰蛋白多关键参数同时检测的方法，本发明基于蛋白在紫外下的UV吸收值和在示差下的RI吸收值均与蛋白浓度呈线性关系；PEG在紫外下无吸收，而其RI吸收值同样与其浓度呈线性关系；PEG修饰后蛋白的PEG部分与蛋白部分互不干扰各自在UV或RI中的吸收值的原理,依据上述原理，本方法可同时进行了包括纯度、蛋白浓度、PEG结合数和游离PEG的四项关键指标的检测。本发明方法适用于不同的蛋白类型及不同PEG修饰剂类型的PEG修饰蛋白，本方法高效便捷、准确度高、操作简单，尤其针对聚乙二醇随机或定点修饰的门冬酰胺酶、激肽原酶进行了检测方法的优化及验证，使得该方法在重复性、精密度等方面都满足了药品级检测要求。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	江苏;32
申请人：	江苏众红生物工程创药研究院有限公司
发明人：	马永;颜莎;周娇娇
专利状态：	有效
申请日期：	2017-11-30T00:00:00+0800
发布日期：	2019-06-07T00:00:00+0800
申请号：	CN201711232136.5
公开号：	CN109856253A
分类号：	G01N30/02(2006.01);G;G01;G01N;G01N30
申请人地址：	213125 江苏省常州市新北区云河路518号
主权项：	1.一种PEG修饰蛋白多关键参数同时高效液相检测方法，同时检测PEG修饰蛋白的纯度、蛋白浓度、PEG结合数和游离PEG，所述方法采用紫外检测和示差检测联用。 2.权利要求1所述的PEG修饰蛋白多关键参数检测方法，其特征在于包含以下步骤：首先，分别对PEG修饰蛋白的原蛋白及其所用PEG的标准品进行紫外和/或示差检测，并建立标准曲线：将蛋白浓度已经标定确定的原蛋白标准品稀释，根据其浓度C原蛋白与相对应的紫外吸收值峰面积UV原蛋白进行线性拟合，建立标准曲线①：UV原蛋白-C原蛋白将蛋白浓度已经标定确定的原蛋白标准品稀释，根据其浓度C原蛋白与相对应的示差吸收值峰面积RI原蛋白进行线性拟合，建立标准曲线②：RI原蛋白-C原蛋白；将PEG标准品溶液稀释，根据其浓度CPEG与相对应的示差吸收值峰面积RIPEG进行线性拟合，建立标准曲线③：RIPEG-CPEG；其次，对供试品同时以紫外、示差检测器检测，并计算得到以下参数： 1)纯度测算：体积排阻色谱柱根据表观分子量大小对供试品的纯度进行分析，采集紫外检测器下的出峰，积分计算纯度； 2)蛋白浓度测算：将供试品溶液在紫外检测器下的峰面积UV修饰蛋白代入标准曲线①，计算得到供试品中的蛋白浓度C原蛋白； 3)游离PEG测算：将供试品溶液在示差检测器下游离PEG的峰面积RI游离PEG代入标准曲线③，计算得到供试品中游离PEG浓度C游离PEG； 4)PEG结合数测算：将上述2)中计算得到含量C原蛋白代入标准曲线②，计算得原蛋白的示差吸收值峰面积RI原蛋白；RIPEG＝RI修饰蛋白-RI原蛋白，代入标准曲线③计算得到修饰蛋白中PEG所占有的含量CPEG，其中，C原蛋白和CPEG分别为修饰蛋白中原蛋白部分和PEG部分的质量浓度，M原蛋白和MPEG分别为原蛋白部分和PEG部分的分子量。 3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，采用体积排阻色谱或者反相色谱进行分离检测。 4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，采用体积排阻色谱法中流动相含5％(V/V)异丙醇的20mM磷酸盐缓冲液，pH6.5。 5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，采用体积排阻色谱法中流动相流速为0.6ml/min。 6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，采用体积排阻色谱法中色谱柱柱温35℃。 7.如权利要求3所述的方法，其特征在于，采用体积排阻色谱法中紫外检测器波长为280nm。 8.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其特征在于，PEG修饰蛋白是聚乙二醇随机或定点修饰的门冬酰胺酶、激肽原酶。
所属类别：	发明专利