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原文传递一种同时检测HAT和TdT的电化学生物传感器的制备方法及其应用

专利名称：	一种同时检测HAT和TdT的电化学生物传感器的制备方法及其应用
摘要：	本发明公开了一种同时检测HAT和TdT的电化学生物传感器的制备方法及其应用，具体步骤如下：(1)将巯基己醇(MCH)滴加到Hg2+诱导的发卡DNA修饰电极表面，记为Electrode1；(2)分别取乙酰转移酶p300、多肽和乙酰辅酶A在磷酸缓冲溶液中(PBS，10mM，pH7.0)充分混合，滴涂于Electrode1表面，记为Electrode2；(3)取Exo I溶液滴涂于Electrode2电极表面，在室温下孵育，再将TdT反应液滴于电极表面，记为Electrode3；(4)向(3)中电极表面滴加Cu2+，再向电极表面滴加抗坏血酸溶液，记为Electrode4，于PBS(0.1M，pH7.0)电解质溶液中检测电化学响应。优点是特异性好、灵敏度高、检测速度快，并且可以同时检测两种酶的活性，结果准确可靠、成本低。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	浙江;33
申请人：	宁波大学
发明人：	胡宇芳;张青青;胡丹丹;马少华;郭智勇;王邃
专利状态：	有效
申请日期：	2019-01-21T00:00:00+0800
发布日期：	2019-06-07T00:00:00+0800
申请号：	CN201910096694.6
公开号：	CN109856212A
分类号：	G01N27/327(2006.01);G;G01;G01N;G01N27
申请人地址：	315211 浙江省宁波市江北区风华路818号宁波大学
主权项：	1.一种同时检测HAT和TdT的电化学生物传感器的制备方法及其应用，其特征在于，具体机理如下：乙酰化反应中生成的CoA，与发卡DNA中的Hg2+结合，使得DNA又变成单链结构，Exo I可以水解该单链DNA，如果没有发生乙酰化反应，该发卡DNA不能变成单链结构却可被TdT催化延长形成富T DNA序列，然后在Cu2+存在的条件下利用抗坏血酸生成CuNCs，通过检测Cu的溶出伏安信号检测p300。同理如果没有TdT存在，由于不能形成富T DNA，从而影响电化学信号输出，因此，同样可以用来检测TdT活性。 2.一种同时检测HAT和TdT的电化学生物传感器的制备方法及其应用，具体步骤如下： (1)将DNA(2.5～7.5μL，0.25～0.75μM)和Hg2+(2.5～7.5μL，0.5～1.5μM)，混合均匀，在37℃下放置30～90min，滴于干净的裸金电极(Au)表面。蒸馏水缓缓冲洗电极，然后滴加巯基己醇(MCH)(2.5～7.5μL，0.1～1.5mM)室温静置30～90min，蒸馏水缓缓冲洗电极，记为Electrode 1。 (2)分别取乙酰转移酶p300(100～1200nM，0.1～1.2μL)、多肽(0.5～1.5mM，0.1～1.2μL)和乙酰辅酶A(0.5～1.5mM，0.5～1.5μL)在磷酸缓冲溶液中(PBS，10mM，pH 7.0)充分混合，总体积1～5μL。将反应液置于28～38℃恒温水浴锅中孵育25～55min。滴涂于Electrode1，在28～40℃下放置15～45min，蒸馏水缓缓冲洗电极，记为Electrode 2。 (3)取Exo I溶液(2.5～7.5μL，0.5～75U/mL)滴涂于Electrode 2电极表面，在室温下孵育30～120min，而后蒸馏水缓缓冲洗电极，将总体积为2.5～7.5μL的TdT反应液(1～3μL3-吗啉丙磺酸缓冲液(MOPS)(10mM MOPS，150mM NaCl，pH 7.6)，0.5～1.5μL 5×TdT缓冲液，以及dTTP(0.5～1.5μL，5～15mM)，TdT(0.5～1.5μL，5～15U/mL))，滴于电极表面，在27～42℃下放置0.5～1.5h，蒸馏水缓缓冲洗电极，记为Electrode 3。 (4)向(3)中电极表面滴加Cu2+(2.5～7.5μL，0.5～1.5mM)，室温孵育10～30min，蒸馏水缓缓冲洗电极。然后向电极表面滴加抗坏血酸溶液(2.5～7.5μL，1～3mM)，室温反应10～30min，蒸馏水缓缓冲洗电极，Electrode 4，于磷酸缓冲溶液(PBS，0.1M，pH 7.0)电解质溶液中检测电化学响应。 3.根据权利要求1所述机理及权利要求2所述传感器制备，其特征在于：用来检测p300和TdT的电化学方法为方波伏安法，电位范围为0～0.3V，振幅为25mV。 4.根据权利要求1～3所述的电化学生物传感器，可以实现不同浓度p300和TdT的检测，其中p300检测限为3pM，TdT检测限为0.0002U/mL。
所属类别：	发明专利