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原文传递一种基于代谢组学的短链氯化石蜡斑马鱼胚胎毒性效应的研究方法

专利名称：	一种基于代谢组学的短链氯化石蜡斑马鱼胚胎毒性效应的研究方法
摘要：	本发明公开了一种基于代谢组学技术的短链氯化石蜡斑马鱼胚胎毒性效应的研究方法，首先通过短链氯化石蜡对斑马鱼胚胎的暴露，建立了快速提取斑马鱼胚胎代谢产物的样品前处理方法，利用UHPLC/Q‑Trap MS能有效地对胚胎体内代谢产物进行分析，结合统计学处理及代谢通路富集分析能直观地反映短链氯化石蜡对斑马鱼胚胎代谢通路的影响。根据胚胎体内代谢物含量的变化初步阐述了短链氯化石蜡的毒性作用机制，基于分子生物学构建了一种胚胎毒性效应评估方法。本发明具有成本低，易于操作，检测快速，灵敏度高，选择性强，重复性好，获得信息全面等优点。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	辽宁;21
申请人：	中国科学院大连化学物理研究所
发明人：	任晓倩;陈吉平;张海军;耿柠波;王菲迪;宋肖垚
专利状态：	有效
申请日期：	2017-12-08T00:00:00+0800
发布日期：	2019-06-18T00:00:00+0800
申请号：	CN201711297076.5
公开号：	CN109900884A
代理机构：	沈阳科苑专利商标代理有限公司
代理人：	马驰
分类号：	G01N33/50(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	116023 辽宁省大连市中山路457号
主权项：	1.一种短链氯化石蜡斑马鱼胚胎毒性效应的评估方法，其特征在于：包括以下步骤： (a)受精后0～4h的斑马鱼胚胎，用短链氯化石蜡对胚胎进行暴露，68～76h后，去离子水快速清洗胚胎表面，收集胚胎样品，液氮淬灭； (b)采用液固萃取法对步骤a所得胚胎样品的小分子代谢产物进行提取； (c)利用基于UHPLC/Q-Trap MS的质谱方法对步骤b所得提取液中的小分子代谢产物进行定量分析； (d)统计学分析处理UHPLC/Q-Trap MS检测的代谢产物，找出含量显著变化的代谢产物，视为差异代谢物，对差异代谢物进行代谢通路富集分析，找到受短链氯化石蜡显著影响的代谢通路； (e)对受显著影响的代谢路径中起关键作用的限速酶活性进行测定，揭示短链氯化石蜡的毒性效应。 2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：步骤a中的容器为烧杯，每个烧杯内加入培养液，胚胎的培养密度为1～50只/烧杯，每个浓度组设置多个平行；暴露所用短链氯化石蜡为C10～C13，平均氯含量为40％～70％；所述暴露操作是将受精正常、发育良好的胚胎随机分配到各个烧杯中，每只烧杯加入含DMSO、含短链氯化石蜡浓度为1μg/L～200μg/L的胚胎培养液100mL，在培养箱内的培养条件为温度27±0.5℃，光暗比12/12；培养液溶解氧至少为空气饱和值的80％，且每24h更换一次培养液。 3.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：步骤b中提取胚胎体内小分子代谢物的过程分为两步：第一步得到细胞破碎液，每个样品加入500uL去离子水，冰水浴中匀浆，得到匀浆液后，冰水浴中超声破碎，破碎时间为5min，得到破碎悬液，冷冻干燥，得到冻干样品；第二步小分子代谢物提取，每个冻干样品中加入500uL含内标的提取液(80％甲醇/水，包含六个内标，200μg/L L-苯丙氨酸-D5，200μg/L氘代辛酰(8,8,8-D3)-L-盐酸肉碱，200μg/L溶血磷脂酰胆碱(12:0)，400μg/L磷脂酰乙醇胺(17:0)，200μg/L十一烷酸，200μg/L十九烷酸)，涡旋30min混匀，8℃下，13000×g离心20min；注射器取上清并且过有机相滤器后，转移至干净离心管，冷冻干燥，得到冻干样品，每个冻干样品加入200uL提取液，复溶，直接用于UHPLC/Q-Trap MS分析。 4.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：步骤c代谢产物的定量分析中，基于代谢物分子性质的差异，分为正负离子两种模式进行扫描，色谱条件如下所述；正离子模式：色谱柱用ACQUITY UPLC BEH C8(1.7μm，2.1×100mm)，流动相A为含甲酸0.1％(v/v)的超纯水，B相为含甲酸0.1％(v/v)的乙腈；流动相梯度洗脱程序为：起始为90％A，3min时下降到60％，15min时下降到0％并维持5min，20.1min时回到90％A，平衡3min；流速为0.35mL/min，柱温为50℃，进样量为5μL；负离子模式：色谱柱用ACQUITY UPLC HSS T3(1.8μm，2.1×100mm)，流动相A为含NH4HCO3 5mmol/L的超纯水，B相为含NH4HCO3 5mmol/L的甲醇；流动相梯度洗脱程序为：起始为98％A并维持1min，3min时下降到58％，12min时下降到0％并维持4min，16.1min时回到98％A，平衡4min；流速为0.35mL/min，柱温为50℃，进样量为5μL；正负离子扫描模式均为Scheduled MRM(有保留时间)模式。 5.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：步骤d中统计学分析基于在线的http://www.metaboanalyst.ca./网站对斑马鱼胚胎内代谢产物的质谱数据进行处理，找出短链氯化石蜡暴露后胚胎内含量显著变化的代谢物，视为差异代谢物；用IncroMap软件对差异代谢物进行代谢通路富集分析，通过对差异代谢物的倍率变化(FC：fold change)数据建立t-test和Q-statistic模型进行分析，基于KEGG数据库找出显著受影响的代谢通路；代谢通路富集分析得到了反映代谢通路受影响程度的Q值，根据Q值，对这些影响通路进行分类。 6.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：经步骤d、步骤e得到了短链氯化石蜡暴露引起的斑马鱼胚胎体内代谢产物含量的变化及受显著影响的代谢路径，并对嘌呤代谢中起关键作用的限速酶活性进行测定，结合这些生物学指标揭示了短链氯化石蜡的斑马鱼胚胎毒性效应。 7.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：所述显著变化，是指经统计学处理后，P<0.05,且VIP值>1的代谢物，认为是差异代谢物。 8.根据权利要求5所述的测定方法，其特征在于：所述显著变化的代谢物，是指对数据首先进行PLS-DA分析，然后进行ANOVA分析，挑选出其中P<0.05且VIP>1的化合物，作为显著变化的代谢物。
所属类别：	发明专利