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原文传递评估人体外受精胚胎质量及差异代谢物的筛选方法

专利名称：	评估人体外受精胚胎质量及差异代谢物的筛选方法
摘要：	本发明涉及一种基于高效气相色谱‑质谱联用技术评估人体外受精胚胎质量及差异代谢物的分析方法。本发明建立了人胚胎培养液代谢组学高分辨分析检测方法。结合胚胎形态学评估，发现了正常发育胚胎与发育阻滞胚胎培养液中的差异代谢物，为评估人体外受精胚胎质量及发育潜能提供新的检测方法和科学依据。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	辽宁;21
申请人：	中国科学院大连化学物理研究所
发明人：	朴海龙;刘秀梅;王稳
专利状态：	有效
申请日期：	2017-12-12T00:00:00+0800
发布日期：	2019-06-21T00:00:00+0800
申请号：	CN201711319650.2
公开号：	CN109917025A
代理机构：	沈阳科苑专利商标代理有限公司
代理人：	马驰
分类号：	G01N30/02(2006.01);G;G01;G01N;G01N30
申请人地址：	116023 辽宁省大连市中山路457号
主权项：	1.一种评估人体外受精胚胎质量及差异代谢物的筛选方法，检测样本为人体外受精胚胎囊胚期的胚胎培养液，对照样本为新鲜培养液；将收集的胚胎培养液依次进行预处理、衍生、气相色谱-质谱检测，实验数据采用软件进行统计分析；根据t检验结果筛选正常发育胚胎与发育阻滞胚胎的差异代谢产物，并根据一种或几种差异代谢物评估体外受精胚胎质量和发育潜能。 2.如权利要求1所述的筛选方法，所述的胚胎培养液预处理方法如下：采集50～100μL培养液，添加2～10倍体积甲醇提取剂(含有内标准品)，涡旋震荡60秒混匀，于14000rpm，4℃离心15～30min，收集上清液，转移到1.5ml离心管中，真空浓缩干燥6～10小时。 3.如权利要求2所述的筛选方法，胚胎培养液和甲醇提取剂体积比为1：2～1：6，最适比例为1：4，内标物质是正十三酸(tridecanoic acid)，终浓度5～10μg/ml。 4.如权利要求1或2所述的筛选方法，所述的胚胎培养液衍生方法如下：加入50～100μL含有20mg/ml吡啶的甲氧胺溶液，置于37℃水浴中肟化反应1～3h，以保护羰基；然后加入40～100μL MSTFA试剂，置于37℃水浴中硅烷化反应1～3h，以增加代谢物的挥发性；硅烷化反应完成后，离心取上清液用于后续的GC-MS分析。 5.如权利要求4所述的筛选方法，胚胎培养液、甲氧胺盐酸盐溶液、MSTFA试剂的体积比为1：1：0.4～1：1：2，最适比例为1：1：0.8。 6.如权利要求1所述的筛选方法，气相色谱-质谱检测的条件：QP 2010 GC-MS系统耦合AOC-20i自动进样器(Shimadzu,Japan)；DB-5MS熔融石英毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm,Agilent Technologies,USA)用于代谢物的色谱分离；进样量1μL，分流比1:10；进样口温度为300℃；氦气(99.9995％，China)作为载气，流速40cm/s，恒线速模式；程序升温条件为：柱温在70℃保持3min，以5℃/min升至300℃，保持10min；质谱调谐采用全氟三丁胺(PFTBA)，离子化采用70eV的电子轰击电离源(EI)；检测电压依据调谐结果设置；传输线和离子源温度分别为280℃和230℃；溶剂切割时间5.0min，MS采集范围33-600m/z，采集频率4scans/s。 7.如权利要求1所述的筛选方法，实验数据采用SIMCA-P 11.5、Mev 4.9和SPSS18.0等软件中的一种或二种以上进行统计分析，根据t检验结果确定差异代谢物。 8.评估人体外受精胚胎质量的差异代谢物，正常发育胚胎与发育阻滞胚胎培养液中葡萄糖、氨基酸和脂肪酸含量差异较大，尤其是天冬氨酸、缬氨酸、亮氨酸、谷氨酸和丝氨酸等含量存在显著差异，可用作评估胚胎发育潜能的代谢指标。 9.评估人体外受精胚胎质量的差异代谢物，胚胎在发育过程中新合成的代谢物，包括柠檬酸、乳酸、棕榈酸和尿素中的一种或二种以上，可用来评估胚胎代谢能力和发育潜能的指标。 10.评估人体外受精胚胎质量的方法，胚胎在发育过程中新合成的代谢物，发育不良的囊胚培养液中柠檬酸、乳酸和棕榈酸中的一种或二种以上的增量低于3～5％，而发育良好的囊胚柠檬酸、乳酸和棕榈酸中的一种或二种以上的含量可以超过8％；通过定量检测新物质的含量和相对比值，可以评估胚胎的代谢能力和发育潜能。
所属类别：	发明专利