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原文传递一种评价人促卵泡激素受体亲和力的分析方法

专利名称：	一种评价人促卵泡激素受体亲和力的分析方法
摘要：	本发明公开了一种利用贴壁细胞‑人卵巢颗粒细胞(KGN细胞)评价人促卵泡激素（hFSH）受体亲和力的分析方法。该方法选择了一种特异性抗人促卵泡激素受体（hFSHR）抗体，通过hFSH与抗hFSHR抗体竞争性结合KGN细胞表面的hFSHR，使得孕酮含量产生变化，由此可比较hFSH对hFSHR的相对亲和力。本发明的方法避免了使用同位素标价法所产生的放射危险以及流式细胞术繁琐的操作过程，可以稳定有效的测定hFSH对于hFSHR的相对亲和力。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	北京;11
申请人：	北京泰德制药股份有限公司
发明人：	梁艳;刘利波
专利状态：	有效
申请日期：	2019-03-19T00:00:00+0800
发布日期：	2019-06-25T00:00:00+0800
申请号：	CN201910208247.5
公开号：	CN109932516A
分类号：	G01N33/76(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	100176 北京市大兴区经济技术开发区荣京东街8号
主权项：	1.一种评价人促卵泡激素体受体亲和力的分析方法，其特征在于该方法选择了一种特异性抗人促卵泡激素受体（hFSHR）抗体，通过hFSH与抗hFSHR抗体竞争性结合KGN细胞表面的hFSHR，使得孕酮含量产生变化，由此测定hFSH对hFSHR的相对亲和力。 2.根据权利要求1所述的一种评价人促卵泡激素受体亲和力的分析方法，其特征在于该方法含有如下步骤：（1）细胞复苏及传代；（2）细胞铺板；（3）抗hFSHR抗体与KGN细胞孵育结合；（4）供试品hFSH竞争结合KGN细胞上的hFSHR；（5）测定孕酮含量。 3.根据权利要求2所述的一种评价人促卵泡激素受体亲和力的分析方法，其特征在于该方法含有如下步骤：（1）细胞复苏及传代将细胞株从液氮罐中取出，迅速放入37℃水浴中，轻轻震摇使其快速融解；在超净台中将其移入离心管中，加入含有胎牛血清（FBS）的DMEM/F-12（简称DF-12）培养基重悬细胞；800rpm离心5min后弃去上清，加入新鲜的细胞培养基，吹打混匀，移至细胞培养瓶中；瓶壁上标明细胞名称、操作日期、细胞代次；（2）细胞铺板将处于对数生长期的人卵巢颗粒细胞肿瘤细胞（KGN）使用胰蛋白酶消化后，弃去胰蛋白酶，加入FBS+DF12培养基终止消化，并且重悬细胞；用细胞计数仪计数后调整细胞浓度；于100µl/孔细胞加入96孔细胞培养板中，37℃，5%CO2条件下培养过夜；（3）抗hFSHR抗体与KGN细胞孵育结合取一支抗hFSHR抗体（Human FSHR Antibody，500μg/支，无菌冻干粉末），用无菌PBS重悬，使其充分溶解，然后用FBS+DF12培养基制备不同浓度的抗hFSHR抗体，将上述抗hFSHR抗体100μl与KGN细胞孵育1~5h；（4）供试品hFSH（自制品和参照药）竞争结合KGN细胞上的hFSHR 使用FBS+DF12培养基将hFSH供试品梯度稀释；将配制好的供试品加入至步骤（3）的96孔板中，使得供试品hFSH与抗hFSHR抗体竞争结合KGN细胞上的hFSHR，100µl/孔，37℃，5%CO2条件下培养48小时以上；（5）测定孕酮含量方法：按照孕酮ELISA试剂盒（厂家：ALPHA DIAGNOSTIC，批号：1955）的操作步骤，在包被好的96孔板中加入步骤（4）中的培养上清25~50µl，加入100~200µl/孔HRP连接酶，室温孵育60min；洗液洗涤3遍后，加入TMB 底物，100~200µl/孔，室温孵育20min后，每孔加入50~100µl的终止液；用酶标仪测定450nm处吸光度；利用SoftMax软件，分别计算自制品和参照药的EC50值，比较其受体亲和力的一致性。 4.根据权利要求3所述的一种评价人促卵泡激素受体亲和力的分析方法，其特征在于，步骤（1）中所使用的细胞为人卵巢颗粒细胞（KGN细胞），用于hFSH受体亲和力的测定。 5.根据权利要求3所述的一种评价人促卵泡激素受体亲和力的分析方法，其特征在于，步骤（2）中细胞铺板时，首先采用8%~12%的FBS+DF12培养基培养过夜，使细胞迅速贴壁生长；之后更换为1%~5%的FBS+DF12培养基。 6.根据权利要求3所述的一种评价人促卵泡激素受体亲和力的分析方法，其特征在于步骤（3）中采用培养基是浓度为1%~5%的FBS+DF12培养基。 7.根据权利要求3所述的一种评价人促卵泡激素受体亲和力的分析方法，其特征在于，步骤（3）中采用了抗hFSHR抗体与KGN细胞孵育1~5h，使其能够与hFSH竞争结合KGN细胞上的FHSR，其浓度范围为：0.1~20000ng/ml。 8.根据权利要求3所述的一种评价人促卵泡激素受体亲和力的分析方法，其特征在于，步骤（4）中使用浓度为1%~5%的FBS+DF12培养基将hFSH供试品梯度稀释。 9.根据权利要求3所述的一种评价人促卵泡激素受体亲和力的分析方法，其特征在于，步骤（4）中hFSH供试品的浓度范围：0.001ng/ml～600ng/ml，稀释梯度为2~5倍，加样刺激细胞产生孕酮的时间为48~120h。 10.根据权利要求3所述的一种评价人促卵泡激素受体亲和力的分析方法，其特征在于，步骤（5）中孕酮含量采用商品化的ELISA试剂盒。
所属类别：	发明专利