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一种糖蛋白多种电荷异构体翻译后修饰的评价方法
| 专利名称： | 一种糖蛋白多种电荷异构体翻译后修饰的评价方法 |
| 摘要： | 本发明公开了一种糖蛋白多种电荷异构体翻译后修饰的评价方法。该方法包括以下步骤：1）通过等电聚焦电泳将多种电荷异质体进行分离；2）对多种电荷异质体分离后的条带进行切割并收集；3）收集后的多种异质体分别进行胶内酶切；4）提取胶内酶切后的肽段；5）对提取后的肽段进行质谱分析，确认氧化、脱酰胺、C末端Lys缺失和糖基化等翻译后修饰。本发明的方法克服了多种电荷异构体对翻译后修饰分析的难点，能够精确分析单一电荷糖蛋白的多种翻译后修饰，更有利于对多种电荷异构体相关的多种翻译后修饰进行精确分析，适用于糖蛋白多种电荷异质体翻译后修饰的分析及评价。 |
| 专利类型： | 发明专利 |
| 国家地区组织代码： | 北京;11 |
| 申请人： | 北京泰德制药股份有限公司 |
| 发明人： | 陈志鑫;何景昌;李维;王鑫;刘利波 |
| 专利状态： | 有效 |
| 申请日期： | 2019-03-19T00:00:00+0800 |
| 发布日期： | 2019-06-25T00:00:00+0800 |
| 申请号： | CN201910208476.7 |
| 公开号： | CN109932444A |
| 分类号： | G01N30/02(2006.01);G;G01;G01N;G01N30 |
| 申请人地址： | 100176 北京市大兴区经济技术开发区荣京东街8号 |
| 主权项： | 1.一种糖蛋白多种电荷异构体翻译后修饰的评价方法,该方法包括以下步骤：（1）通过垂直等电聚焦电泳将多种电荷异质体进行分离，对电泳后的凝胶进行固定并染色；（2）对分离后的多种电荷异质体条带编号，切割并收集到离心管中；（3）将收集后的多个凝胶条带样品脱色，再进行还原和烷基化处理，最后使用胰蛋白酶进行胶内酶切；（4）酶切完毕后，对酶切后的肽段使用含甲酸的乙腈溶液进行提取；（5）对提取后的肽段进行超高效液相串联质谱分析，确认多种翻译后修饰。 2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的糖蛋白为血管内皮细胞生长因子受体Fc融合蛋白。 3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于其中所述的等电聚焦电泳所用凝胶为IEF凝胶，固定液为三氯乙酸溶液，染色液为考马斯亮蓝染色液。 4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（3）中使用二硫苏糖醇溶液对糖蛋白进行还原处理，加入二硫苏糖醇溶液的浓度为0.5M-1M，对蛋白进行还原处理的二硫苏糖醇终浓度为2-25mM。 5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（3）中使用碘乙酰胺（IAM）进行烷基化处理， 碘乙酰胺的浓度为5-25Mm。 6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（3）使用胰蛋白酶与蛋白用量的质量比为1:25~1:100（w/w）。 7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（4）中使用含甲酸、乙酸或三氟乙酸的50%乙腈溶液对肽段进行提取。 8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（4）中使用含甲酸的50%乙腈溶液对肽段进行提取。 9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于使用含甲酸、乙酸或三氟乙酸的50%乙腈溶液对糖链进行提取，其中优选含有0.1%-5%甲酸的50%的乙腈溶液。 |
| 所属类别： | 发明专利 |
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