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原文传递一种糖蛋白多种电荷异构体N糖链结构的评价方法

专利名称：	一种糖蛋白多种电荷异构体N糖链结构的评价方法
摘要：	本发明公开了一种糖蛋白多种电荷异构体N糖链结构的评价方法。该方法包括以下步骤：电荷异质体分离、电荷异质体收集、胶内酶切、糖链富集、糖链标记、糖链纯化、质谱分析。本发明发现等电聚焦电泳（IEF）分离多种电荷异构体及胶内酶切的手段用于分析N糖链结构的，克服了多种电荷异构体对N糖链结构分析的难点，能够精确分析单一电荷糖蛋白的N糖链结构，更有利于对多种电荷异构体N糖结构进行精确分析，适用于糖蛋白多种电荷异质体N糖链结构的分析与评价。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	北京;11
申请人：	北京泰德制药股份有限公司
发明人：	何景昌;陈志鑫;李维;王鑫;刘利波
专利状态：	有效
申请日期：	2019-03-19T00:00:00+0800
发布日期：	2019-06-25T00:00:00+0800
申请号：	CN201910208722.9
公开号：	CN109932445A
分类号：	G01N30/02(2006.01);G;G01;G01N;G01N30
申请人地址：	100176 北京市大兴区经济技术开发区荣京东街8号
主权项：	1.一种糖蛋白多种电荷异构体N糖链结构的评价方法，该方法包括以下步骤：（1）电荷异质体分离：通过等电聚焦电泳将多种电荷异质体进行分离，对电泳后的凝胶进行固定并染色；（2）电荷异质体收集：对分离后的多种电荷异质体条带编号，切割并收集到离心管中；（3）胶内酶切：将收集后的多个凝胶条带样品脱色，再进行还原和烷基化处理，最后使用糖苷酶F进行胶内酶切；（4）糖链富集：酶切完毕后，提取胶内酶切后的糖链，使用有机溶剂对溶液中的蛋白进行沉淀，收集上清液并干燥，富集糖链；（5）糖链标记：使用甲酸处理富集的糖链并进行干燥，然后对干燥的糖链使用2-氨基苯甲酰胺（2-AB）进行荧光标记；（6）糖链纯化：使用N糖纯化小柱对标记的糖链进行纯化，收集标记糖链；（7）质谱分析：对标记后的糖链进行荧光质谱分析，确认N糖链结构。 2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于其中糖蛋白为重组人血管内皮细胞生长因子受体Fc融合蛋白。 3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于其中步骤（1）中所述的等电聚焦电泳所用凝胶为IEF凝胶，固定液为三氯乙酸溶液，染色液为考马斯亮蓝染色液。 4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于其中步骤（1）中所述的等电聚焦电泳采用水平电聚焦电泳或垂直等电聚焦电泳。 5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于其中步骤（3）中使用二硫苏糖醇对糖蛋白进行还原处理，使用碘乙酰胺对糖蛋白进行烷基化处理。 6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于其中步骤（3）中加入二硫苏糖醇溶液的浓度为0.5M-1M，对蛋白进行还原处理的DTT终浓度为2-25mM，碘乙酰胺的浓度为5-62.5 mM。 7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于其中步骤（3）中使用糖苷酶F的终浓度为2-20U/μl。 8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于使用含甲酸、乙酸或三氟乙酸的50%乙腈溶液对糖链进行提取，其中优选含有甲酸的50%的乙腈溶液。 9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（4）中的有机溶剂是甲醇、乙醇或丁醇，其中优选乙醇。 10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（6）使用GlycoWorks HILIC 1cc小柱对糖链进行纯化。 11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（7）对纯化后的糖链使用超高效液相色谱串联电喷雾-四极杆-飞行时间质谱法进行数据采集，并结合质谱软件进行数据分析。
所属类别：	发明专利