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原文传递呋虫胺原药对鱼的早期生命阶段毒性的试验方法

专利名称：	呋虫胺原药对鱼的早期生命阶段毒性的试验方法
摘要：	本发明公开了呋虫胺原药对鱼的早期生命阶段毒性的试验方法，包括供试品选取、仪器设备选取、供试生物选取、操作方法、质量控制和结果与讨论五个步骤，通过对同时设置空白对照组，对照组和试验组均设若干个重复，每个重复设有相同粒鱼卵，增加了参考数据，提高了数据的准确性，提高采用采用半静态试验方法，定期更新药液，在试验暴露期间，合理的观察和记录相关数据，降低了外在因素对试验的干扰，提高了试验结果准确性。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	浙江;33
申请人：	浙江省农业科学院
发明人：	王彦华;李薪芳;俞瑞鲜;许振岚;吴声敢;王菲迪;王强
专利状态：	有效
申请日期：	2019-03-06T00:00:00+0800
发布日期：	2019-07-02T00:00:00+0800
申请号：	CN201910169539.2
公开号：	CN109959766A
代理机构：	北京众合诚成知识产权代理有限公司
代理人：	苗艳荣
分类号：	G01N33/15(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	310021 浙江省杭州市德胜中路298号浙江省农科院2号楼239室
主权项：	1.呋虫胺原药对鱼的早期生命阶段毒性的试验方法，其特征在于：包括供试品选取、仪器设备选取、供试生物选取、操作方法、质量控制和结果与讨论五个步骤。 2.根据权利要求1所述的呋虫胺原药对鱼的早期生命阶段毒性的试验方法，其特征在于：所述供试品选取时选取98％呋虫胺原药，且保证其在20℃时，在水中39.83g/L和甲醇57g/L。 3.根据权利要求1所述的呋虫胺原药对鱼的早期生命阶段毒性的试验方法，其特征在于：所述仪器设备选取AB135-S型电子天平、BSA 223S型电子天平、三洋MLR-350HT培养箱、CD-6OSX数显游标卡尺、SX-620型笔式pH计、HACH HQ30d型溶解氧分析仪、HANNA HI96735型水质硬度仪、KQ2200型超声波清洗器、旋转蒸发仪、移液管、24孔板、500mL烧杯和1000mL容量瓶。 4.根据权利要求1所述的呋虫胺原药对鱼的早期生命阶段毒性的试验方法，其特征在于：所述供试生物选取时选取斑马鱼作为供试生物，且种鱼购买自中国科学院水生生物研究所，试验用的胚胎是亲鱼斑马鱼为本机构繁殖所得，AB型品系，试验前，斑马鱼亲鱼在水温为26±1℃的空调控温，光照时间与黑暗时间比为14h:10h，且光照时保证其在4.8m×3.0m房间内自然光照，外加4支40W日光灯照明，曝气充氧的环境条件下饲养至少2周，预养时每天喂食1次，并及时清除粪便及食物残渣。 5.根据权利要求1所述的呋虫胺原药对鱼的早期生命阶段毒性的试验方法，其特征在于：所述操作方法包括以下步骤： A、标准稀释水的配制：氯化钙溶液：将11.76g CaCl2·2H2O溶解于蒸馏水中，并稀释至1L；硫酸镁溶液：将4.93g MgSO4·7H2O溶解于蒸馏水中，并稀释至1L；碳酸氢钠溶液：将2.59g NaHCO3溶解于蒸馏水中，并稀释至1L；氯化钾溶液：将0.23g KCl溶解于蒸馏水中，并稀释至1L各取以上四种溶液25ml加以混合并用水稀释至1L，在试验过程中，根据试验所需体积，按上述比例配制标准稀释水； B、试验浓度：300mg a.i./L为最高浓度，按2.0倍设置300、150、75.0、37.5、18.75和9.375mg a.i./L共6个处理浓度，且各浓度允许变动范围为±20％，同时设置不加药处理为空白对照； C、试验溶液的配制：称取98％呋虫胺原药约1.786g，用去离子水定容至50.0mL容量瓶，得浓度为35000mg a.i./L的母液，且贮存在4℃的冰箱中，然后用去离子水稀释可得试验贮备液，最后用标准稀释水将贮备液分别稀释至各试验浓度，药液每2d更换一次，药液更新时取已配置的浓度为35000mg a.i./L的母液，用标准稀释水分别稀释至各试验药液； D、染毒：染毒是针对胚胎和仔鱼，且胚胎和仔鱼染毒步骤如下：胚胎：以24孔板为胚胎孵化容器，用滴管将健康的斑马鱼胚胎(孵出后4h内)转入24孔板内，每孔内加入1枚胚胎及2mL不同浓度的药液，每个浓度设4个重复，每个重复15枚胚胎，然后置于三洋MLR-350HT培养箱中，温度26±1℃，光照周期14h:10h(光照:黑暗)条件下进行孵化，每天记录胚胎死亡数和孵化时间；仔鱼：胚胎孵化结束后，记录仔鱼尾数，并将其转入含有200mL对应浓度的药剂的玻璃烧杯内，试验周期为孵出后30d，试验期间每2d更换一次药液，斑马鱼的初孵首次喂食时间为产卵后4-5d，前三天饲喂蛋黄，之后喂食丰年虫，一天喂两次，喂食量视实际情况而定，做到既要能够自由摄取，又要避免过剩； E、试验条件监测：试验期间，每周测量一次温度和溶解氧，试验开始和结束时，测定药液的硬度和pH值； F、试验调查：每天观察一次孵出和存活情况，并记录数量，每周检查1次仔鱼畸形情况、畸形数量和异常行为，并及时清除烧杯内杂物及死亡个体，暴露结束后，将对照组和各浓度处理组所有存活幼鱼用MS-222麻醉，逐一测量体长、湿重，用游标卡尺测定体长，用电子天平称量湿重； G、数据计算与统计分析：根据试验药液浓度和鱼的孵化数、死亡数等，用DPS统计分析软件，将斑马鱼幼鱼阶段慢性毒性试验数据进行统计分析，求出所测定的无可观察浓度和最低可观察效应浓度，若试验期间受试物浓度变化维持在配制浓度±20％的范围内，则用配制浓度来计算。 6.根据权利要求1所述的呋虫胺原药对鱼的早期生命阶段毒性的试验方法，其特征在于：所述质量控制为试验期间，溶解氧浓度应为60-80％的空气饱和值；温度为26±1℃；受试物浓度应保持在平均测量值的±20％范围内；试验结束时，对照组中，幼鱼存活率不低于70％；试验容器之间的水温差不能超过±1.5℃。 7.根据权利要求1所述的呋虫胺原药对鱼的早期生命阶段毒性的试验方法，其特征在于：所述结果与讨论通过试验溶液温度、硬度、溶解氧和pH值测量得出相关数据，然后根据每天胚胎孵化数量、死亡数量、开始孵化时间和全部孵化时间和每天孵出仔鱼数量对试验结果进行分析，得出相关数据。 8.根据权利要求5所述的呋虫胺原药对鱼的早期生命阶段毒性的试验方法，其特征在于：所述步骤D中药液更新时，在新容器内加入新配制的试验药液，然后用塑料吸管将存活的仔鱼转移到含有新鲜药液的容器中。 9.根据权利要求5所述的呋虫胺原药对鱼的早期生命阶段毒性的试验方法，其特征在于：所述步骤F中用电子天平的感量为0.00001g，并且称量湿重时需吸干体表水分。
所属类别：	发明专利