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原文传递用于模拟疾病和评估其治疗副作用的系统和方法

专利名称：	用于模拟疾病和评估其治疗副作用的系统和方法
摘要：	本公开提供了一种用于如源自多能干细胞的心室心肌细胞等心肌细胞的有序生长和发育的基质，以及在基质上培养细胞以供在如心脏毒性测定等测定中使用的方法。进一步提供了用于使用本文公开的一个或多个标准评估心脏毒性的方法。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	中国香港;81
申请人：	再心生物科技有限公司
发明人：	李登伟
专利状态：	有效
申请日期：	2017-08-11T00:00:00+0800
发布日期：	2019-07-05T00:00:00+0800
申请号：	CN201780055692.1
公开号：	CN109983342A
代理机构：	上海德昭知识产权代理有限公司
代理人：	郁旦蓉
分类号：	G01N33/50(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	中国香港新界沙田香港科学园科技大道西15号8楼811-813室
主权项：	1.一种评估化合物的心脏毒性的方法，其包括： (a)使微加工基质上的各向异性心脏细胞层与化合物接触； (b)在一个或多个点刺激所述各向异性细胞层； (c)检测所述各向异性细胞层中的电信号传播；以及 (d)确定所述化合物是否展现心脏毒性。 2.根据权利要求1所述的方法，其中所述各向异性细胞层包括衍生自人类的患者特异性心脏细胞或疾病特异性心脏细胞。 3.根据权利要求1所述的方法，其中所述微加工基质包括沿所述基质的单轴定向的凹槽。 4.根据权利要求3所述的方法，其中所述凹槽具有类似尺寸。 5.根据权利要求4所述的方法，其中所述凹槽的宽度为1μm到30μm。 6.根据权利要求5所述的方法，其中所述凹槽的宽度为5μm到15μm。 7.根据权利要求6所述的方法，其中所述凹槽的宽度为15μm。 8.根据权利要求3所述的方法，其中所述凹槽的深度为约5μm。 9.根据权利要求3所述的方法，其中凹槽之间的间距为约5μm。 10.根据权利要求1所述的方法，其中所述微加工基质为聚苯乙烯。 11.根据权利要求1所述的方法，其中所述各向异性心脏细胞层在某一点受到刺激。 12.根据权利要求11所述的方法，其中所述刺激为5伏到30伏，脉冲持续时间为5毫秒到30毫秒。 13.根据权利要求12所述的方法，其中所述刺激为10伏，脉冲持续时间为10毫秒。 14.根据权利要求1所述的方法，其中如果化合物在所述各向异性心脏细胞层中诱发螺旋电传播波，则所述化合物被确定为展现心脏毒性。 15.根据权利要求1所述的方法，其中所述化合物为1A类、1B类或1C类抗心律失常化合物。 16.根据权利要求1所述的方法，其中所述各向异性心脏细胞层包括至少为70％肌钙蛋白T+的心肌细胞。 17.根据权利要求1所述的方法，其中在不暴露于化合物的情况下，所述各向异性心脏细胞层不展现折返事件。 18.根据权利要求1所述的方法，其中所述各向异性心脏细胞层已经经历了程控电刺激，其包括以1.5赫兹(Hz)传递的八个S1刺激的序列，随后是过早额外刺激(S2)，S1-S2间隔开始于550毫秒(ms)，并且以50ms的步长连续缩短直到捕获失败，此时所述S1-S2间隔增加20ms，随后是2ms衰减，直到达到有效不应期(ERP)，其中所述ERP被定义为未能导致AP传播的最大S1-S2间隔。 19.根据权利要求1所述的方法，其中当对1C类抗心律失常化合物的暴露从0.3μM到3μM逐渐增加时，所述各向异性心脏细胞层展现出APD50传导速度的逐步剂量依赖性减慢。 20.根据权利要求1所述的方法，其中响应于1A类抗心律失常化合物，所述各向异性心脏细胞层展现出剂量依赖性APD90延长。 21.根据权利要求1所述的方法，其中响应于1A类抗心律失常化合物，所述各向异性心脏细胞层展现出折返事件的至少两倍增加。 22.根据权利要求1所述的方法，其中响应于1B类抗心律失常化合物，所述各向异性心脏细胞层不展现出剂量依赖性APD90延长。 23.根据权利要求1所述的方法，其中响应于1B类抗心律失常化合物，所述各向异性心脏细胞层不展现出折返事件的增加。 24.一种鉴定适于在体外心脏毒性测定中使用的心肌细胞的方法，其包括： (a)使衍生自多能干细胞的心肌细胞与微加工基质接触；以及 (b)将适于在体外心脏毒性测定中使用的心肌细胞鉴定为展现至少两种以下性质的心肌细胞： (i)响应于电点刺激，各向异性比率至少1.8的辐射传导图案； (ii)至少70％的心脏肌钙蛋白T+； (iii)至少1.5Hz的最大捕获频率； (iv)响应于从0.5Hz到3Hz(10V，10ms)具有0.5Hz增量直到失去1:1捕获的稳态起搏，不存在折返事件；或者 (v)响应于程控电刺激，不存在诱导的螺旋波，所述程控电刺激包括第一序列的八个电脉冲(S1)，之后是第二序列电脉冲(S2)，其中S1-S2间隔逐渐缩短。 25.根据权利要求24所述的方法，其进一步包括： (a)将所述心肌细胞暴露于治疗有效量的1C类抗心律失常化合物；以及 (b)如果所述1C类抗心律失常化合物诱导信号传导速度的剂量依赖性减慢，则将所述心肌细胞鉴定为适于在体外心脏毒性测定中使用。 26.根据权利要求25所述的方法，其中所述1C类抗心律失常化合物是氟卡胺。 27.根据权利要求24所述的方法，其进一步包括： (a)将所述心肌细胞暴露于治疗有效量的1A类抗心律失常化合物；以及 (b)如果所述1A类抗心律失常化合物诱导传导速度的剂量依赖性减慢，则将所述心肌细胞鉴定为适于在体外心脏毒性测定中使用。 28.根据权利要求27所述的方法，其中所述1A类抗心律失常化合物是普鲁卡因胺。 29.根据权利要求24所述的方法，其进一步包括： (a)将所述心肌细胞暴露于治疗有效量的1B类抗心律失常化合物；以及 (b)如果所述1B类抗心律失常化合物不诱导信号传导速度的剂量依赖性减慢，则将所述心肌细胞鉴定为适于在体外心脏毒性测定中使用。 30.根据权利要求29所述的方法，其中所述1B类抗心律失常化合物是妥卡尼。 31.根据权利要求24所述的方法，其进一步包括： (a)将所述心肌细胞暴露于特非那定；以及 (b)如果所述特非那定在100nM浓度下不诱导折返事件，但当在300nM浓度下施用所述特非那定时，相对于暴露于生理惰性对照化合物，折返事件的可能性增加至少1.2倍，则将所述心肌细胞鉴定为适于在体外心脏毒性测定中使用。 32.根据权利要求24所述的方法，其进一步包括： (a)将所述心肌细胞暴露于西沙必利；以及 (b)如果相对于暴露于生理惰性对照化合物，所述西沙必利使折返事件的可能性增加至少2.7倍，则将所述心肌细胞鉴定为适于在体外心脏毒性测定中使用。 33.一种产生各向异性心脏细胞层的方法，其包括： (a)解离至少80％汇合的多能干细胞培养物以产生单个细胞； (b)在约5％的O2和约5％的CO2的低氧条件下悬浮培养单个细胞约8天以产生培养细胞，其中所述培养包括： (i)在补充有10μM Rho激酶抑制剂、1ng/mL骨形态发生蛋白-4和40μg/mL基质胶的mTeSRTM-l培养基中孵育所述细胞约24小时； (ii)在含有50μg/mL抗坏血酸、2mM GlutaMAXTM、10ng/mL BMP4和10ng/mL活化素-A的-34SFM完全培养基中进一步孵育所述细胞约3天； (iii)在含有50μg/mL抗坏血酸、2mM GlutaMAXTM和5μM Wnt抑制剂的-34SFM完全培养基中继续孵育所述细胞约3天； (iv)在环境O2、5％CO2条件下在第8天将所述细胞转移到含有50μg/mL抗坏血酸的-34SFM完全培养基中以产生心肌球； (c)在含有50μg/mL抗坏血酸的34SFM完全培养基中维持所述心肌球直到第15到22天，其中每3到4天补充培养基； (d)通过暴露于1mg/mL胶原酶30分钟，然后暴露于0.05％胰蛋白酶3分钟来解离所述心肌球； (e)将所述心肌球接种到基质胶涂覆的微加工基质上以形成各向异性心脏细胞层； (f)将所述各向异性心脏细胞层在含有10％热灭活胎牛血清、1X GlutaMAXTM和1X Mem非必需氨基酸的高葡萄糖(4.5g/L)DMEM培养基中孵育2天；以及 (g)每隔2天用RPMI 1640培养基补充所述培养基持续至少7天，从而产生各向异性心脏细胞层。 34.根据权利要求33所述的方法，其中所述多能干细胞培养物是人类多能干细胞培养物。 35.根据权利要求33所述的方法，其中所述多能干细胞培养物是用accutase解离的。 36.根据权利要求33所述的方法，其中所述Wnt抑制剂是IWR-1。 37.一种制造微加工基质的方法，其包括： (a)使用光刻法生成弹性体模具以产生具有一系列沿同一轴线定向的通道的模具，其中每个通道为3μm到10μm深且2μm到50μm宽，其中通道之间的间距为3μm到10μm； (b)使用热量将步骤(a)的特征压印到塑料上以产生基质； (c)暴露所述基质以进行UVO处理约8分钟；以及 (d)通过在化学灭菌剂中将所述基质灭菌来产生所述微加工基质。 38.根据权利要求37所述的方法，其中所述弹性体模具是聚二甲基硅氧烷模具。 39.根据权利要求37所述的方法，其中所述通道的深度大致相同。 40.根据权利要求39所述的方法，其中所述通道深度为约5μm。 41.根据权利要求37所述的方法，其中所述通道的宽度大致相同。 42.根据权利要求41所述的方法，其中所述通道宽度为约10μm或约15μm。 43.根据权利要求37所述的方法，其中所述通道之间的间距大致相同。 44.根据权利要求43所述的方法，其中所述通道间距为约5μm。 45.一种模拟心脏病的系统，其包括生物混合材料，所述生物混合材料包括：(a)人类心肌细胞，和(b)用于细胞附着的微加工基质。 46.根据权利要求45所述的系统，其中所述心脏病为心律失常。 47.根据权利要求46所述的系统，其中所述疾病为长QT综合征、布鲁格达综合征、遗传性心脏病、淀粉样变、早衰、糖尿病昏迷症、水母中毒、甲状腺功能亢进、黄热病、美洲锥虫病、主动脉瓣返流、处方药滥用导致心律失常、雷特综合征、心肌炎、三尖瓣闭锁、莱姆病、丘-施综合征、涉及心律失常的心脏病或心力衰竭形式、心脏增大、心碎综合征、甲状腺结节、房室管缺损、霍乱、二尖瓣狭窄、多系统萎缩(MSA)、打鼾、二尖瓣脱垂、羊水栓塞、坏疽、再生障碍性贫血、成人先天性心脏病、热衰竭、格雷夫斯病、心肌病、心室早发性收缩、心动过缓、疲劳、心动过速、头晕或呼吸急促。 48.一种筛选心脏病治疗剂的方法，其包括(a)在维持细胞活力的条件下孵育各向异性心脏细胞层；(b)使所述心脏细胞与心脏病候选治疗剂接触；以及(c)测量所述心脏病候选治疗剂对心脏细胞的效应，其中如果所述心脏病候选治疗剂减少所述心脏细胞中心脏病的症状，则将所述心脏病候选治疗剂鉴定为心脏病治疗剂。 49.根据权利要求48所述的方法，其中所述心脏细胞附着于微加工基质上。 50.根据权利要求48所述的方法，其中所述心脏病为心律失常。 51.根据权利要求50所述的方法，其中所述心脏病为长QT综合征、布鲁格达综合征、遗传性心脏病、淀粉样变、早衰、糖尿病昏迷症、水母中毒、甲状腺功能亢进、黄热病、美洲锥虫病、主动脉瓣返流、处方药滥用导致心律失常、雷特综合征、心肌炎、三尖瓣闭锁、莱姆病、丘-施综合征、涉及心律失常的心脏病或心力衰竭形式、心脏增大、心碎综合征、甲状腺结节、房室管缺损、霍乱、二尖瓣狭窄、多系统萎缩(MSA)、打鼾、二尖瓣脱垂、羊水栓塞、坏疽、再生障碍性贫血、成人先天性心脏病、热衰竭、格雷夫斯病、心肌病、心室早发性收缩、心动过缓、疲劳、心动过速、头晕或呼吸急促。 52.一种用于评估化合物的心脏毒性效应的方法，其包括(a)使各向异性心脏细胞层与化合物接触；以及(b)测量所述化合物对所述心脏细胞的心脏毒性效应。 53.根据权利要求52所述的方法，其中所述心脏细胞附着于微加工基质上。 54.根据权利要求52所述的方法，其中所述各向异性心脏细胞层为健康细胞。 55.根据权利要求52所述的方法，其中所述各向异性心脏细胞层被遗传学地、化学地、物理学地或电学地布置成治疗心脏病。 56.根据权利要求55所述的方法，其中所述心脏病为长QT综合征、布鲁格达综合征、遗传性心脏病、淀粉样变、早衰、糖尿病昏迷症、水母中毒、甲状腺功能亢进、黄热病、美洲锥虫病、主动脉瓣返流、处方药滥用导致心律失常、雷特综合征、心肌炎、三尖瓣闭锁、莱姆病、丘-施综合征、涉及心律失常的心脏病或心力衰竭形式、心脏增大、心碎综合征、甲状腺结节、房室管缺损、霍乱、二尖瓣狭窄、多系统萎缩(MSA)、打鼾、二尖瓣脱垂、羊水栓塞、坏疽、再生障碍性贫血、成人先天性心脏病、热衰竭、格雷夫斯病、心肌病、心室早发性收缩、心动过缓、疲劳、心动过速、头晕或呼吸急促。 57.根据权利要求52所述的方法，其中所述心脏毒性效应为心律失常。 58.根据权利要求1、33、48或52中任一项所述的方法，其中所述心脏细胞是心室心脏细胞。 59.根据权利要求24或45中任一项所述的方法，其中所述心肌细胞是心室心肌细胞。
所属类别：	发明专利