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原文传递一种基于核酸适配体的超灵敏检测多巴胺的方法

专利名称：	一种基于核酸适配体的超灵敏检测多巴胺的方法
摘要：	本发明提供了一种基于核酸适配体的超灵敏检测多巴胺的方法，首先将ssDNA1与多巴胺适配体、ssDNA2通过碱基互补配对原则结合形成具有两个3’突出末端的双链DNA1，其中，ssDNA2的碱基数少于ssDNA1并与ssDNA1互补配对，多巴胺适配体自ssDNA2的3’末端开始与ssDNA1部分互补配对；之后加入待测样品、发夹DNA、荧光染料SYBR Green Ⅰ以及核酸外切酶Ⅲ，其中，所述发夹DNA的碱基数少于ssDNA1并能与游离的ssDNA1通过碱基互补配对原则形成发夹DNA链3’末端凹陷的双链DNA2。本发明通过多巴胺适配体识别多巴胺，使适配体从双链DNA1中脱离，从而不断引发酶切反应，荧光信号降低，利用此循环放大技术实现了对多巴胺的超灵敏检测。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	河北;13
申请人：	河北医科大学
发明人：	牛凌梅;康维钧;王艳仙
专利状态：	有效
申请日期：	2019-04-25T00:00:00+0800
发布日期：	2019-07-05T00:00:00+0800
申请号：	CN201910341109.4
公开号：	CN109975561A
代理机构：	石家庄国域专利商标事务所有限公司
代理人：	白海静
分类号：	G01N33/94(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	050017 河北省石家庄市中山东路361号
主权项：	1.一种基于核酸适配体的超灵敏检测多巴胺的方法，其特征是，首先将ssDNA1与多巴胺适配体、ssDNA2通过碱基互补配对原则结合形成具有两个3’突出末端的双链DNA1，其中，ssDNA2的碱基数少于ssDNA1并与ssDNA1互补配对，多巴胺适配体自ssDNA2的3’末端开始与ssDNA1部分互补配对；之后加入待测样品、发夹DNA、荧光染料SYBR Green Ⅰ以及核酸外切酶Ⅲ，其中，所述发夹DNA的碱基数少于ssDNA1并能与游离的ssDNA1通过碱基互补配对原则形成发夹DNA 链3’末端凹陷的双链DNA2；待测样品中的多巴胺从双链DNA1中竞争得到多巴胺适配体，使得剩余的双链DNA1形成3’末端凹陷的结构，从而引发核酸外切酶 Ⅲ 的酶切反应形成游离的ssDNA1，发夹DNA与游离的ssDNA1通过碱基互补配对原则形成发夹DNA 链3’末端凹陷的双链DNA2，进而再次引发核酸外切酶 Ⅲ的酶切反应，如此循环使得位于双链DNA结构中的荧光染料SYBR Green Ⅰ不断被释放出来，导致荧光信号减小，通过荧光信号的减少量与多巴胺浓度的线性关系得到待测样品的多巴胺浓度。 2.根据权利要求1所述的基于核酸适配体的超灵敏检测多巴胺的方法，其特征是，包括以下步骤： a、将等摩尔量的多巴胺适配体、ssDNA1、ssDNA2加入到Tris-HCl溶液中，室温条件下进行孵育，然后加入待测样品，并在室温条件下进行反应；其中，多巴胺适配体序列如序列表中的序列1所示，ssDNA1序列如序列表中的序列2所示，ssDNA2序列如序列表中的序列3所示； b、向步骤a得到的反应液中加入发夹DNA和荧光染料SYBR Green Ⅰ溶液，反应完全后，加入核酸外切酶Ⅲ进行酶切反应，反应完成后冷却至室温；其中，发夹DNA序列如序列表中的序列4所示； c、用荧光分光光度计对步骤b得到的反应液进行检测，获得待测样品对应的荧光信号的减少量，再通过预先测得的荧光信号的减少量与多巴胺浓度的标准曲线获得待测样品的多巴胺浓度。 3.根据权利要求2所述的基于核酸适配体的超灵敏检测多巴胺的方法，其特征是，步骤a中，多巴胺适配体、ssDNA1、ssDNA2的孵育时间为5小时。 4.根据权利要求2所述的基于核酸适配体的超灵敏检测多巴胺的方法，其特征是，步骤b中，酶切反应条件为：加入70U 核酸外切酶Ⅲ，于37℃孵育1小时。 5.根据权利要求2所述的基于核酸适配体的超灵敏检测多巴胺的方法，其特征是，步骤c中，荧光分光光度计的激发波长为497nm，荧光发射光谱在510~600nm检测，激发和发射狭缝为10.0 nm，温度为25℃。
所属类别：	发明专利