详情

原文传递一种提升利托那韦药物抗癌有效性的检测方法

专利名称：	一种提升利托那韦药物抗癌有效性的检测方法
摘要：	本发明属于医药学技术领域，公开了一种提升利托那韦药物抗癌有效性的检测方法，根据肿瘤组织在体的生长情况，检验生物血液及组织中雌激素的浓度，或在不同雌激素水平下进行癌细胞体外培养，通过包括MTT、划痕、免疫荧光、western blot、实时荧光定量PCR、流式细胞术在内的实验，明确利托那韦在内的抗癌药物对肿瘤细胞的有效抗癌范围以及抗癌活性对雌激素水平的依赖。本发明通过测定患者体内雌激素水平，配合患者雌激素水平的周期性变化设计利托那韦在内的抗癌药物给药方案，实现利托那韦在内的抗癌药物对包括乳腺癌在内多种肿瘤的精准治疗。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	湖北;42
申请人：	武汉大学
发明人：	项瑾;任静;缪雨阳;刘翔;戚苗苗;陈坤
专利状态：	有效
申请日期：	2019-05-05T00:00:00+0800
发布日期：	2019-07-05T00:00:00+0800
申请号：	CN201910368111.0
公开号：	CN109975499A
代理机构：	北京金智普华知识产权代理有限公司
代理人：	杨采良
分类号：	G01N33/15(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	430072 湖北省武汉市武昌区八一路299号
主权项：	1.一种提升利托那韦药物抗癌有效性的检测方法，其特征在于，所述提升利托那韦药物抗癌有效性的检测方法，根据肿瘤组织在体内的生长情况，检验生物血液及组织中雌激素的浓度，或在不同雌激素水平下进行癌细胞体外培养，通过包括MTT、划痕、免疫荧光、western blot、实时荧光定量PCR、流式细胞在内的实验，检验在不同雌激素水平下，利托那韦在内的抗癌药物对不同肿瘤细胞的有效抗癌范围以及抗癌活性。 2.如权利要求1所述的提升利托那韦药物抗癌有效性的检测方法，其特征在于，利托那韦在内的抗癌药物包括与骨骼，乳房，中枢神经系统，心脑血管系统，睾丸，卵巢，肝脏，肺，膀胱，前列腺，消化道，肾脏，肾上腺，甲状腺，骨骼肌器官在内有雌激素受体表达的雌激素相关癌症的抗癌药物，其抗癌活性受雌激素的影响。 3.如权利要求1所述的提升利托那韦药物抗癌有效性的检测方法，其特征在于，所述提升利托那韦药物抗癌有效性的检测方法进一步包括：根据包括瘤体尺寸、重量在内的肿瘤组织在体的生长情况，或肿瘤组织免疫组化、探针标记的实验结果，对血样或组织匀浆样进行3500rpm及10分钟的离心，取上清，-20℃储存；800μL血浆或组织匀浆样、50μL IS工作液和50μL0.1M的盐酸混合均匀；用2mL己烷∶乙酸乙酯萃取；涡旋混匀样品，4℃离心3分钟，有机相转移至另一玻璃管，蒸发至干，用100μL10mM的碳酸钠和100μL丹磺酰氯丙酮溶液重新溶解； 60℃加热6分钟，用2mL己烷∶乙酸乙酯重新萃取，蒸发至干，于300μL乙腈：水+0.1％甲酸中重新溶解后用LC-MS/MS(液相色谱质谱联用)进行生物样品中雌激素水平的分析。 4.如权利要求3所述的提升利托那韦药物抗癌有效性的检测方法，其特征在于，IS工作液为50％甲醇稀释的氘标记雌激素标准液,IS的质量体积比为1mg/mL。 5.如权利要求3所述的提升利托那韦药物抗癌有效性的检测方法，其特征在于，己烷∶乙酸乙酯的质量比为1∶1。 6.如权利要求1所述的提升利托那韦药物抗癌有效性的检测方法，其特征在于，雌激素在0～1nM浓度范围内。 7.如权利要求1所述的提升利托那韦药物抗癌有效性的检测方法，其特征在于，利托那韦在内的抗癌药物浓度在0-160μM浓度范围内。 8.如权利要求1所述的提升利托那韦药物抗癌有效性的检测方法，其特征在于，MTT实验方法包括：选择癌症病理组织或体外培养生长情况良好的癌细胞，用胰酶消化后，1000rpm离心5min后去上清，将细胞团用完全培养基重悬，细胞接种于96孔板，接种密度为5×103个/孔，用0～160μM浓度范围利托那韦在内的抗癌药物、0～160μM浓度范围的利托那韦在内的抗癌药物中分别加入0～1nM浓度范围的雌二醇处理癌细胞，48h后加入10μL5mg/mL噻唑蓝，37℃、5％二氧化碳继续培养4h，加入100μL二甲基亚砜；充分振荡使细胞内的紫蓝色结晶完全溶解，在酶标仪上测定波长为570nm的吸光度；对照组存活率为100％，利托那韦处理过的细胞存活率＝(实验组吸光度-空白组吸光度)/(对照组吸光度-空白组吸光度)×100％，空白组只加培养液、噻唑蓝、二甲基亚砜，对照组药物浓度为零；重复噻唑蓝分析实验六次；划痕实验方法包括：选择癌症病理组织或体外培养生长情况良好的癌细胞，用胰酶消化后，1000rpm离心5min后去上清，将细胞团用完全培养基重悬为密度约5×105个/ml的细胞悬液，将细胞悬液以2ml/孔接种于六孔板中，在37℃、5％CO2的培养箱中培养；24h后，用200μL枪头在单细胞层上划一条划痕，用PBS洗涤两次以除去细胞碎片；然后用0～160μM浓度范围的利托那韦在内的抗癌药物和0～1nM浓度范围的雌激素处理癌细胞；在培养0～24h的时间范围内选取不同时间点在倒置显微镜下观察划痕区域并拍照，每个给药组拍摄2～5个标记位置；通过计算划痕区域的面积计算划痕愈合率；愈合率％＝(0h划痕面积-各时间点划痕面积)/0h划痕面积×100％；免疫荧光实验方法包括：选择癌症病理组织或体外培养生长情况良好的癌细胞，用胰酶消化后，1000rpm离心5min后去上清，将细胞团用完全培养基重悬，在共聚焦培养皿上接种癌细胞，接种密度为105个/mL，用0～160μM浓度范围的利托那韦在内的抗癌药物和0～1nM浓度范围的雌激素处理癌细胞1h后,将细胞用PBS配制4％的多聚甲醛固定10分钟，加入PBS配制0.2％的TritonX-100处理10分钟，PBS配制5％的BSA封闭反应30分钟，在加入稀释100倍的待检测基因对应的蛋白一抗在4℃混合孵育过夜，PBS洗5次，加入稀释100倍的荧光标记二抗室温孵育1小时，PBS洗3次，最后用Hochest室温染核5分钟，PBS洗3次； western blot免疫印迹实验包括：用0～160μM浓度范围的利托那韦在内的抗癌药物和0～1nM浓度范围的雌激素处理癌症病理组织或体外培养癌细胞1h后，加入200μL冰冻裂解液；无酚红-MEM培养基加入利托那韦在内的抗癌药物的溶剂后平行培养细胞作为空白对照；超声处理裂解物，12000g离心2分钟，收集上清液，添加蛋白样品上样缓冲液，100℃煮沸5分钟，10％十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离；将蛋白质从凝胶转移至硝酸纤维素膜，用三羟甲基氨基甲烷与‰1吐温20缓冲液洗膜；将膜用5％脱脂牛奶在室温下封闭2小时，TBST洗膜三次；用稀释后的待检测基因对应的蛋白一抗与膜于4℃孵育过夜，TBST洗膜三次,膜与稀释后的辣根过氧化物酶偶联二抗在37℃下孵育一小时,TBST洗膜三次，用显色试剂盒进行显色；β-actin抗体处理作为内参对照；透射电镜方法包括：用0～160μM浓度范围的利托那韦在内的抗癌药物和0～1nM浓度范围的雌激素处理癌症病理组织或体外培养癌细胞1h后，将细胞用2.5％戊二醛溶液于4℃固定2h,使用细胞刮刀将细胞从培养瓶中刮下，离心混合物以去除上清；用1％锇酸在4℃固定2h后，用1M PBS缓冲液溶液冲洗三次；用30％-50％-70％-80％-90％的丙酮梯度脱水后，再浸入丙酮：包埋剂为1：1的稀释包埋剂中，室温1h；再浸入纯包埋剂中，37℃过夜；60℃固化48h；超博切片机切片，然后用醋酸双氧铀和枸橼酸铅双电子染色；实时荧光定量PCR分析方法包括：用0～160μM浓度范围的利托那韦在内的抗癌药物和0～1nM浓度范围的雌激素处理癌症病理组织或体外培养癌细胞1h后，用TRIzol试剂提取细胞中的总RNA，通过测量280nm与260nm光密度比值对回收RNA进行定量检测；1‰二硫亚砜处理组作为空白对照；取4微克RNA用于cDNA合成； GAPDH基因被用于校准差异，根据2-△△Ct方法分析待检测基因表达的相对变化。 9.一种利用权利要求1所述提升利托那韦药物抗癌有效性的检测方法在钙磷脂结合蛋白Annexin V、B淋巴细胞瘤-2基因、天冬氨酸蛋白水解酶家族、癌基因C-myc、抑癌基因P53在内的癌细胞凋亡相关基因、癌细胞迁移相关基因、自噬相关基因、雌激素受体基因、G蛋白偶联雌激素受体基因、雌激素受体靶向基因、G蛋白偶联雌激素受体靶向基因抗癌有效性检测的应用。 10.一种利用权利要求1所述提升利托那韦药物抗癌有效性的检测方法在雌激素总量、雌酮、雌二醇、雌三醇、孕酮、孕二醇、孕三醇、睾酮、脱氢表雄酮、促卵泡激素、黄体生成素、β-绒毛膜促性腺激素、胎盘生乳素、催乳素在内的雌激素及相关性激素检测的应用。
所属类别：	发明专利