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原文传递一种免疫检测试剂盒及其应用

专利名称：	一种免疫检测试剂盒及其应用
摘要：	本发明涉及生物技术领域的一种免疫检测试剂盒及其应用。该试剂盒包括特异性识别人免疫复合物的第一抗体；所述第一抗体能够特异性识别人免疫复合物中与抗原结合后的目标抗体，但不识别游离的人IgG以及游离的目标抗体。所述特异性识别人免疫复合物的第一抗体包括单克隆抗体和多克隆抗体，且利用含该抗体的试剂盒实现了间接法在均相免疫检测平台中的应用。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	上海;31
申请人：	博阳生物科技(上海)有限公司
发明人：	陈英豪;赵卫国;刘宇卉;李临;其他发明人请求不公开姓名
专利状态：	有效
申请日期：	2017-12-29T00:00:00+0800
发布日期：	2019-07-09T00:00:00+0800
申请号：	CN201711472827.2
公开号：	CN109991405A
代理机构：	北京聿宏知识产权代理有限公司
代理人：	吴大建;方莉
分类号：	G01N33/53(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	201210 上海市浦东新区自由贸易试验区蔡伦路88号五楼东面
主权项：	1.一种免疫检测试剂盒，其包括能够特异性识别人免疫复合物的第一抗体；所述第一抗体能够特异性识别人免疫复合物中与抗原结合后的目标抗体，但不识别游离的人IgG以及游离的目标抗体。 2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述第一抗体通过识别表位与人免疫复合物中与抗原结合后的目标抗体相结合；所述识别表位为构象表位和/或线性表位。 3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述识别表位位于所述人免疫复合物中与抗原结合后的目标抗体的恒定区。 4.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于，所述识别表位不位于所述人免疫复合物中与抗原结合后的目标抗体的轻链部分。 5.根据权利要求2-4中任意一项所述的试剂盒，其特征在于，所述识别表位位于所述人免疫复合物中与抗原结合后的目标抗体的Fc段。 6.根据权利要求2-5中任意一项所述的试剂盒，其特征在于，所述识别表位的氨基酸序列包含5～10个氨基酸。 7.根据权利要求1-6中任意一项所述的试剂盒，其特征在于，所述第一抗体为多克隆抗体。 8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述第一抗体的制备方法包括：用人免疫复合物对动物进行免疫，获取含有第一抗体的动物血清；然后所述动物血清经亲和层析纯化得到特异性识别人免疫复合物的第一抗体。 9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述第一抗体的制备方法具体包括以下步骤： S1，用第一组人免疫复合物对动物进行免疫，免疫结束后，收集动物血清； S2，将所述动物血清上样至结合有第二组人免疫复合物的亲和层析柱上，经洗涤、洗脱后，获得含特异性识别人免疫复合物的第一抗体的洗脱液； S3，将所述洗脱液经透析后上样至抗人IgG亲和层析柱上，穿透液中获得特异性识别人免疫复合物的第一抗体。 10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述结合有第二组人免疫复合物的亲和层析柱的制备方法为：将与免疫时不同的抗原固定在亲和层析柱上，然后将与所述抗原特异反应的阳性人血清上样至所述亲和层析柱上，使阳性人血清中的特异性抗体与所述抗原形成第二组人免疫复合物，获得结合有第二组人免疫复合物的亲和层析柱。 11.根据权利要求9或10所述的试剂盒，其特征在于，步骤S2中，所述动物血清上样前通过盐析进行粗提。 12.根据权利要求9-11中任意一项所述的试剂盒，其特征在于，所述动物对人IgG免疫耐受。 13.根据权利要求1-6中任意一项所述的试剂盒，其特征在于，所述第一抗体为单克隆抗体。 14.根据权利要求13所述的试剂盒，其特征在于，所述第一抗体的制备方法包括：将经人免疫复合物免疫后的小鼠的脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合后进行培养，对细胞培养上清液进行检测，并保留阳性细胞株。 15.根据权利要求14所述的试剂盒，其特征在于，所述第一抗体的制备方法具体包括以下步骤： T1，用第一组人免疫复合物对小鼠进行免疫，免疫结束后，获取小鼠的脾脏细胞； T2，将小鼠的脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合后进行克隆培养，获得细胞培养上清液； T3，利用表面结合有第二组人免疫复合物的酶标板对所述细胞培养上清液进行间接法ELISA检测，获得阳性反应克隆； T4，将所述阳性反应克隆分别与表面结合有与步骤T3相同抗原的酶标板和表面结合有人IgG的酶标板进行间接法ELISA检测，舍弃有任意一项为阳性反应的所述阳性反应克隆； T5，剩余的阳性反应克隆的稳定细胞株经培养或制备腹水，获得特异性识别人免疫复合物的第一抗体。 16.根据权利要求15所述的试剂盒，其特征在于，所述表面结合有第二组人免疫复合物的酶标板的制备方法为：将与免疫时不同的抗原结合到酶标板上，然后加入与所述抗原特异反应的阳性人血清，反应后洗涤，获得表面结合有第二组人免疫复合物的酶标板。 17.根据权利要求15或16所述的试剂盒，其特征在于，步骤T2中，所述小鼠骨髓瘤细胞为小鼠骨髓瘤细胞SP2/0。 18.根据权利要求13所述的试剂盒，其特征在于，所述第一抗体的制备方法包括：其将经人免疫复合物免疫后的小鼠的脾脏细胞的总RNA反转录的cDNA为模板的PCR扩增产物克隆至噬菌体中；然后筛选出阳性噬菌体，并对阳性噬菌体上的抗体基因进行重组表达，获得特异性识别抗人免疫复合物的单克隆抗体。 19.根据权利要求18所述的试剂盒，其特征在于，所述第一抗体的制备方法具体包括以下步骤： M1，用第一组人免疫复合物对小鼠进行免疫，免疫结束后，获取小鼠脾脏细胞的总RNA； M2，将所述总RNA反转录至cDNA后，以cDNA为模板，利用小鼠IgG特异性引物进行PCR扩增，获得扩增产物； M3，将扩增产物克隆至噬菌体中，并将克隆所得噬菌体与结合于固相表面的第二组人免疫复合物进行反应，获取阳性噬菌体； M4，将所述阳性噬菌体上的抗体基因进行重组表达和纯化，获得特异性识别人免疫复合物的第一抗体。 20.根据权利要求19所述的试剂盒，其特征在于，将与免疫时不同的抗原固定至固相表面，然后加入与所述抗原特异反应的阳性人血清，反应后洗涤，形成结合于固相表面的第二组人免疫复合物。 21.根据权利要求14-20中任意一项所述的试剂盒，其特征在于，所述小鼠对人IgG免疫耐受。 22.一种如权利要求1-21中任意一项所述的试剂盒在均相化学发光检测方法中的应用。 23.一种均相免疫检测试剂盒，其包括以下试剂：试剂1：其包括如权利要求1-21中任意一项所述试剂盒中包含的能够特异性识别人免疫复合物的第一抗体，其与第一标记物相结合；试剂2：其包括在激发状态下生成单线态氧的供体，所述供体与第二标记物相结合；所述第二标记物能够与第一标记物特异性结合；试剂3：其包括与单线态氧反应生成可检测信号的受体，所述受体与已知抗原相结合，所述已知抗原能够与待检抗体特异性结合。 24.根据权利要求23所述的试剂盒，其特征在于，所述第一标记物和第二标记物中的任一种为生物素，另一种为链霉亲和素；优选地，所述第一标记物为生物素，第二标记物为链霉亲和素。 25.根据权利要求23或24所述的试剂盒，其特征在于，所述受体包含烯烃化合物和金属螯合物，所述受体为非粒子形式，且在含水介质中可溶；和/或，所述受体为填充有发光化合物和镧系元素的高分子微粒。 26.根据权利要求23-25任意一项所述的试剂盒，其特征在于，所述供体是光活化的或化学活化的敏化剂，非粒子形式，且在含水介质中可溶；和/或，所述供体为填充有感光化合物的高分子微粒，在光激发下能够产生单线态氧。 27.根据权利要求1-26中任意一项所述的试剂盒，其特征在于，所述第一抗体的浓度为0.1～10ug/ml；优选为0.5～5ug/ml；进一步优选为1～3ug/ml。 28.一种如权利要求1-21中任意一项所述的免疫检测试剂盒或如权利要求23-27中任意一项所述的均相免疫检测试剂盒在检测人血清或血浆中待测抗体中的应用。
所属类别：	发明专利