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原文传递一种基于核酸适配体荧光传感器用于多目标物检测的方法

专利名称：	一种基于核酸适配体荧光传感器用于多目标物检测的方法
摘要：	本发明公开了一种基于核酸适配体荧光传感器用于多目标物检测的方法，首次应用了聚吡咯纳米粒和DNA‑银纳米簇建立了基于空间位阻效应的适配体传感平台。并且，基于聚吡咯纳米粒低非特异性吸附特性，本发明取得了良好的检测结果，基于适配体序列特异性识别特性，实现多目标物检测，扩宽本发明普适性能。本发明中目标物的检测方法具有免标记，无酶，灵敏度高的优点，能够实现在生物样品中的高效检测。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	江苏;32
申请人：	南京医科大学
发明人：	周学敏;洪俊丽;王晶;李昺之;卢巧云;李晓芸;翁晨园;严孝强
专利状态：	有效
申请日期：	2019-04-16T00:00:00+0800
发布日期：	2019-07-09T00:00:00+0800
申请号：	CN201910305023.6
公开号：	CN109991202A
代理机构：	北京思创大成知识产权代理有限公司
代理人：	尹慧晶
分类号：	G01N21/64(2006.01);G;G01;G01N;G01N21
申请人地址：	210029 江苏省南京市江宁区龙眠大道101号
主权项：	1.一种基于核酸适配体荧光传感器用于多目标物检测的方法，其特征在于检测方法包括如下步骤： a)将DNA-银纳米簇与聚吡咯纳米粒在缓冲液1中混合并孵育； b)将多个不同浓度的目标物分子干扰素-γ、腺苷和凝血酶分别加入步骤a)得到的混合体系进行反应并孵育； c)分别将步骤b)所得混合物测其在535nm激发波长下，625nm处的荧光值，利用测得的I625处荧光读数与未加入目标物分子时I625荧光读数差值比例Fr，获得干扰素-γ、腺苷或凝血酶浓度与Fr的线性关系； d)将待测样品与步骤a)所得混合体系混合，然后测其I625处荧光读数，根据步骤c)所得到的线性关系与待测样品获得的荧光强度，继而得到待测样品中干扰素-γ、腺苷和凝血酶的浓度。 2.根据权利要求1所述的一种基于核酸适配体荧光传感器用于多目标物检测的方法，其特征在于步骤a)中所述的缓冲液1具体配方是10mM Na2HPO4/NaH2PO4、100mM CH3COONa和10mM Mg(CH3COOH)2,pH＝7.4。 3.根据权利要求1所述的基于核酸适配体荧光传感器用于多目标物检测的方法，其特征在于是用以下DNA序列制备AgP1(干扰素-γ)、AgP2(腺苷)和AgP3(凝血酶)三种DNA-银纳米簇： AgP1模板：ACCCGAACCTGGGCTACCACCCTTAATCCCCACCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGGT。 AgP2模板：ACCCGAACCTGGGCTACCACCCTTAATCCCCGGTTGGTGTGGTTGG。 AgP3模板；ACCCGAACCTGGGCTACCACCCTTAATCCCCGGGGTTGGTTGTGTTGGGTGTTGTGT。 4.根据权利要求3所述的基于核酸适配体荧光传感器用于多目标物检测的方法，其特征在于，步骤a)中DNA-银纳米簇与聚吡咯纳米粒在缓冲液1中混合步骤为：用缓冲液1将聚吡咯纳米粒稀释至0.12mg/mL，随后，将5μL,15μM的AgP1，5μL,15μM的AgP2和5μL,15μM的AgP3与40μL,0.12mg/mL的聚吡咯纳米粒混合。 5.根据权利要求1所述的基于核酸适配体荧光传感器用于多目标物检测的方法，其特征在于步骤a)所述的孵育为在36-38℃下孵育10-15min，优选孵育为在37℃下孵育15min。 6.根据权利要求1所述的基于核酸适配体荧光传感器用于多目标物检测的方法，其特征在于步骤b)所述的干扰素-γ的浓度范围是2nM-25nM，腺苷的浓度范围是0nM-12.5nM，凝血酶的浓度范围是2nM-25nM。 7.根据权利要求6所述的基于核酸适配体荧光传感器用于多目标物检测的方法，其特征在于，步骤b)具体为：每45μL步骤a)制备的混合体系与体积为20μL浓度为2nM-25nM的干扰素-γ溶液或体积为20μL浓度为0nM-12.5nM的腺苷或体积为20μL浓度为2nM-25nM的凝血酶溶液混合，再加入35μL缓冲液3，在37℃下反应1h；其中，缓冲液3为10mMTris-HCl缓冲液,pH8，10mM氯化钾，15mM氯化镁。 8.根据权利要求1所述的基于核酸适配体荧光传感器用于多目标物检测的方法，其特征在于，步骤c)具体为：将步骤b)所得混合物分别在激发波长为535nm，测定625nm处的荧光值；扫描速度为1200nm/min，光电倍增管电压为900V，激发狭缝和发射狭缝宽度为5nm，利用测得的I625荧光读数差值比例Fr，获得目标物浓度与Fr的线性关系。 9.根据权利要求1所述的基于核酸适配体荧光传感器用于多目标物检测的方法，其特征在于所述的DNA-银纳米簇是单链DNA为模板，加入硝酸银、硼氢化钠，使其原位还原生成；所述的聚吡咯纳米粒是以吡咯单体、聚乙烯吡咯烷酮、氯化铁为原料，合成得到。 10.根据权利要求3所述的基于核酸适配体荧光传感器用于多目标物检测的方法，其特征在于，所述的DNA-银纳米簇是通过以下步骤制备得到的：将1OD的AgP1模板溶解于975μL缓冲液2中，加热至95℃，维持10min后迅速转移至冰水浴中，快速降温，随后加入12μL，10mM新制硝酸银溶液，涡旋混合后避光4℃反应30min，接着，迅速加入12μL，10mM新制硼氢化钠溶液，充分振摇混合1min，然后避光4℃反应过夜；将1OD的AgP2模板溶解于975μL缓冲液2中，加热至95℃，维持10min后迅速转移至冰水浴中，快速降温，随后加入16μL，10mM新制硝酸银溶液，涡旋混合后避光4℃反应30min，接着，迅速加入8μL，10mM新制硼氢化钠溶液，充分振摇混合1min，然后避光4℃反应过夜；将1OD的AgP3模板溶解于975μL缓冲液2中，加热至95℃，维持10min后缓慢降温至37℃，降温持续时间为1h，随后加入14μL，10mM新制硝酸银溶液，涡旋混合后避光4℃反应30min，接着，迅速加入10μL，10mM新制硼氢化钠溶液，充分振摇混合1min，然后避光4℃反应过夜；其中，所述的缓冲液2为10mM柠檬酸盐缓冲液,pH6.8；所述的聚吡咯纳米粒是通过以下步骤制备得到的：将0.4g分子量为348.48的十二烷基苯磺酸钠预溶于300ml超纯水中，持续搅拌使其完全溶解。随后逐滴加入3mL吡咯单体，匀速搅拌1h。接着逐滴缓慢加入30mL,1.68g的FeCl3·6H2O溶液，在0-5℃下反应4h，最后用超纯水和乙醇溶液离心洗涤多次，得到聚吡咯纳米粒。
所属类别：	发明专利