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原文传递一种血液样本中胰岛素类似物的检测方法

专利名称：	一种血液样本中胰岛素类似物的检测方法
摘要：	本发明涉及一种血液样本中胰岛素类似物的检测方法，包括如下步骤：(1)确定LC‑MS/MS条件；(2)绘制标准曲线，将胰岛素类似物溶于甲醇中，稀释制成胰岛素类似物标准溶液，再加入大鼠血浆样本中制成胰岛素类似物标准曲线样品，将标准曲线样品通过前处理后以LC‑MS/MS条件分别检测标准曲线样品，并根据检测结果绘制胰岛素类似物的标准曲线；(3)样品检测，将待测血液样本通过前处理后，以LC‑MS/MS条件进行检测，并将检测结果与标准曲线对照计算出待测血液样本中胰岛素类似物的含量。本发明的检测方法克服了现有技术中检测方法无法实现胰岛素类似物在体内较低浓度水平的精准定量检测的缺陷，为胰岛素类似物在动物体内的药代动力学中的检测提供了简便的分析方法。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	江苏;32
申请人：	苏州旭辉检测有限公司
发明人：	李小川;张枢;黄晓琳
专利状态：	有效
申请日期：	2019-03-27T00:00:00+0800
发布日期：	2019-07-09T00:00:00+0800
申请号：	CN201910235456.9
公开号：	CN109991351A
代理机构：	北京科亿知识产权代理事务所(普通合伙)
代理人：	汤东凤
分类号：	G01N30/88(2006.01);G;G01;G01N;G01N30
申请人地址：	215316 江苏省苏州市昆山市玉山镇元丰路168号3号房
主权项：	1.一种血液样本中胰岛素类似物的检测方法，其特征在于：采用液相-质谱联用系统对胰岛素类似物进行分析；检测方法包括以下步骤：步骤一：确定LC-MS/MS条件： LC条件如下：流动相：流动相A：含质量比0.1％乙酸的乙腈；流动相B：含质量比0.1％乙酸的水；梯度洗脱条件包括如下三个阶段：第一阶段：起始流动相体积比：A:B＝90:10；第二阶段：流动相体积比：A:B＝52:48；第三阶段：流动相体积比：A:B＝5:95；第四阶段：流动相体积比：A:B＝90:10至结束；且第一阶段和第三阶段的洗脱时间之和大于或等于1.5min；流速：0.25mL/min；进样量：10μL； MS条件如下：检测方式：多反应监测MRM；扫描方式：正离子扫描；离子喷雾电压：5500V；离子喷雾电压：5500V；气帘气：35；雾化气：55；辅助气：50；离子源温度：250℃；碰撞气种类：N2；碰撞气压力：High 步骤二：绘制标准曲线：将胰岛素类似物溶于甲醇中，稀释制成胰岛素类似物浓度为1.7ppb-3400ppb的标准溶液，再加入大鼠血浆样本中，制成胰岛素类似物浓度为0.17ppb～340ppb的标准曲线样品；将标准曲线样品通过前处理后，以所述LC-MS/MS条件分别检测标准曲线样品，并根据检测结果绘制胰岛素类似物的标准曲线；步骤三：样品检测：将待测血液样本通过前处理后，以所述LC-MS/MS条件进行检测，并将检测结果与所述标准曲线对照，计算出待测血液样本中胰岛素类似物的含量；步骤二中标准曲线样品的前处理包括如下步骤：取45ul动物血浆加入5ul胰岛素类似物标准曲线样品溶液，涡旋10s,然后加入100ul甲醇沉淀蛋白，涡旋2min,低温高速离心10min，取上清；步骤三中待测血液样品的前处理包括如下步骤：取45ul动物血浆加入5ul待测血液样本溶液，涡旋10s,然后加入100ul甲醇沉淀蛋白，涡旋2min,低温高速离心10min，取上清。 2.根据权利要求1所述的血液样本中胰岛素类似物的检测方法，其特征在于：步骤一中所述的LC条件中，使用的高效液相色谱仪的型号为Agilent1100、Agilent1200、Agilent1260、Agilent1290、岛津LC-20A和岛津LC-30A中的任意一种。 3.根据权利要求1所述的血液样本中胰岛素类似物的检测方法，其特征在于：步骤一中所述的LC条件中，液相色谱柱为Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18、Agilent ZORBAXEclipse Plus-C18、Agilent ZORBAX SB-C18、Waters SunFire C18、Waters CSH C18、Agela Venusil XBP C18中的任意一种。 4.根据权利要求1所述的血液样本中胰岛素类似物的检测方法，其特征在于：步骤一中所述的LC条件中，梯度洗脱条件为：起始流动相体积比：A:B＝90:10；步骤①：0～3.5min，流动相体积比由A:B＝90:10匀速上升至A:B＝52:48；步骤②：3.5～3.8min，流动相体积比A:B＝52:48；步骤③：3.8～4.0min，流动相体积比由A:B＝52:48匀速上升至A:B＝5:95；步骤④：4.0～6.0min，流动相体积比A:B＝5:95；步骤⑤：6.0～6.1min，流动相体积比由A:B＝5:95匀速下降至A:B＝90:10；步骤⑥：6.1～8.5min，A:B＝90:10；其中步骤①和步骤⑥的洗脱时间之和大于4min。 5.根据权利要求1所述的血液样本中胰岛素类似物的检测方法，其特征在于：步骤一中所述的LC条件中，液相色谱柱的柱温为25～35℃。 6.根据权利要求1所述的血液样本中胰岛素类似物的检测方法，其特征在于：步骤一中所述的MS条件中，所使用的质谱仪的型号为SCIEX5500，6500，6500+，所使用的离子源为电喷雾离子源。 7.根据权利要求1所述的血液样本中胰岛素类似物的检测方法，其特征在于：步骤一中所述的MS条件中，离子源温度为200-350℃。 8.根据权利要求1所述的血液样本中胰岛素类似物的检测方法，其特征在于：步骤二中绘制标准曲线时选择胰岛素类似物浓度为340ppb、170ppb、34ppb、6.8ppb、3.4ppb、0.68ppb和0.17ppb的标准曲线样品。 9.根据权利要求1所述的血液样本中胰岛素类似物的检测方法，其特征在于：步骤三中待测血液样本的前处理中，离心的条件为：13000转/分钟，10分钟，4℃。
所属类别：	发明专利