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原文传递羊支原体肺炎免疫胶体金标记快速诊断试纸制备方法

专利名称：	羊支原体肺炎免疫胶体金标记快速诊断试纸制备方法
摘要：	本发明公开了一种羊支原体肺炎免疫胶体金标记快速诊断试纸制备方法，包括用羊肺炎支原体BNCC126187株RPS11基因质粒重组纯化抗原为免疫抗原，制备羊支原体肺炎特异性单克隆抗体；经胶体金颗粒单克隆抗体蛋白标记、纯化、质量鉴定及条件优化，建立羊支原体肺炎胶体金免疫层析检测方法；将得到的鼠RPS11单克隆抗体与胶体金探针结合在玻璃纤维膜上，与固相NC膜组装得到金标检测试纸条。本发明研制的金标诊断检测试纸条对羊支原体肺炎的诊断检测具有快速、灵敏、特异及操作简便的良好特性，为羊支原体肺炎的早期诊断检测及流行病学调查工作开展奠定了良好的技术基础。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	贵州;52
申请人：	贵州省畜牧兽医研究所
发明人：	王璇;文正常;吴玙彤;潘淑惠
专利状态：	有效
申请日期：	2019-04-22T00:00:00+0800
发布日期：	2019-07-12T00:00:00+0800
申请号：	CN201910324838.9
公开号：	CN110007081A
代理机构：	贵阳中新专利商标事务所
代理人：	李余江;程新敏
分类号：	G01N33/569(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	550005 贵州省贵阳市南明区小碧乡老里坡
主权项：	1.一种羊支原体肺炎免疫胶体金标记快速诊断试纸制备方法，其特征在于：用羊肺炎支原体BNCC126187株RPS11基因质粒重组纯化抗原为免疫抗原，制备羊支原体肺炎特异性单克隆抗体；经胶体金颗粒单克隆抗体蛋白标记、纯化、质量鉴定及条件优化，建立羊支原体肺炎胶体金免疫层析检测方法；将得到的鼠RPS11单克隆抗体与胶体金探针结合在玻璃纤维膜上，与固相NC膜组装得到金标检测试纸条。 2.根据权利要求1所述的羊支原体肺炎免疫胶体金标记快速诊断试纸制备方法，其特征在于：所述羊支原体肺炎特异性单克隆抗体制备方法包括如下步骤： S1，动物免疫：将纯化的pET28a-RPS11重组蛋白作为免疫抗原对雌性小鼠进行皮下多点注射，经3次免疫后小鼠静脉采血，收集血清包被后，用间接ELISA法检测血清抗体效价，并选择性加强免疫； S2，间接ELISA检测方法的建立与免疫效价检测：用纯化的pET28a-RPS11重组纯化蛋白作为抗原，按常规方法建立间接ELISA；通过方阵滴定，确定抗原包被浓度以及阳性血清的最佳稀释度，对免疫小鼠进行血清效价检测； S3，细胞融合：摘除眼球处死小鼠，并收集阳性对照血，取出脾脏，制备成单细胞悬液，然后取出处于对数期的SP2/0细胞处理后，与脾细胞以一定比例混合，50％PEG1450作用后，以基础培养基DMEM稀释终止，低速离心后，再用含胎牛血清的HAT培养基轻轻悬浮并混匀，培养、观察和记录细胞生长情况； S4，杂交瘤细胞的筛选与克隆：将SP2/0细胞与免疫小鼠脾脏细胞杂交融合并换液，在显微镜下观察，当融合细胞长至培养孔底面积10％时，吸取上清，用间接ELISA酶标板筛选确定出阳性孔后，按有限稀释法连续亚克隆直至阳性率达100％；细胞定株后扩大培养选用胎牛血清培养基，当细胞密度达到设定值时，离心处理、收集沉淀并冻存； S5，单克隆抗体小鼠腹水的制备：选择小鼠先用液体石蜡行小鼠腹腔注射，一周后将杂交瘤细胞经PBS重悬后接种到小鼠腹腔中，待小鼠腹部膨大后采集腹水，收集腹水离心，准备纯化； S6，单克隆抗体的纯化：用足够的起始缓冲液平衡Protein G-琼脂糖亲和层析柱；取待纯化的样品上柱，洗涤，收集洗脱液；纯化的单克隆抗体用SDS-PAGE鉴定其纯度。 3.根据权利要求1所述的羊支原体肺炎免疫胶体金标记快速诊断试纸制备方法，其特征在于：胶体金免疫层析方法的建立包括如下步骤： S11，胶体金溶液的制备：取HAuCl4水溶液加热煮沸，加入枸橼酸三钠水溶液煮沸至橙红色，制备成胶体金颗粒溶液； S12，胶体金标记蛋白的制备：取若干小玻璃试管，分别加入制备好的胶体金溶液，用碳酸钾溶液将胶体金溶液的PH分别调为梯度植，取RPS11标记单抗溶液加入上述胶体金管中，混匀后室温放置，然后每管分别加入NaCl溶液，混匀，室温静置，观察胶体金颜色变化，记录保持红色的最低PH；再将PH调为梯度最低PH±0.1；重复上述试验；记录仍保持红色的最低PH，即为最适PH； S13，标记抗体最适量的选择：采用蛋白梯度法确定RPS11标记单克隆抗体与胶体金结合的最适浓度； S14，胶体金探针的制备和纯化：将最适PH胶体金溶液加入RPS11标记单克隆抗体，在室温下电磁搅拌，制得胶体金－抗体结合物溶液，将BSA加入制得的胶体金－抗体结合物溶液中，室温搅拌，离心，吸出上清，将沉淀物溶于BSA的PB液中重悬，滤膜过滤，保存备用； S15，胶体金－抗体结合物原液工作浓度的确定和金标垫的制备：用工作液将胶体金－抗体结合物原液按不同比例进行稀释，取胶体金－抗体结合物稀释液，均匀地加在玻璃纤维膜上，烤干，即为金标垫，测试后确定胶体金标记抗体的最适工作浓度； S16，不同型号硝酸纤维素膜的选择：选择几种不同型号的NC膜，通过包括跑板功能测试、胶体金溶液在不同型号NC膜上流动性、滞后度和背景残留的测试和NC膜的重新选择测试在内的试验，确定最适型号的NC膜； S17，检测线及质控线条件的建立和优化：将NC膜上T线及C线的包被抗体设置几个浓度梯度，选择显色效果最优的一组作为RPS11单克隆抗体使用浓度T线和羊抗鼠IgG抗体使用浓度C线； S18，T线及C线的点膜：用PBS将鼠RPS11单克隆抗体和羊抗鼠IgG抗体分别稀释至所需浓度，用划膜机在NC膜上点膜；喷好的NC膜置烤干干燥。 4.根据权利要求1所述的羊支原体肺炎免疫胶体金标记快速诊断试纸制备方法，其特征在于：金标检测试纸条的组装包括如下步骤：将PVC底板切条，在PVC底板中间粘贴抗体固相NC膜，在PVC底板下端粘贴玻璃纤维膜探针条带，并与固相抗体NC膜部分重叠，然后在下端粘贴样本垫与探针条带部分重叠，在PVC底板上端粘贴吸水纸，并与抗体固相NC膜部分重叠，切成试纸条。
所属类别：	发明专利