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原文传递羊传染性胸膜肺炎间接ELISA检测诊断试剂制备方法

专利名称：	羊传染性胸膜肺炎间接ELISA检测诊断试剂制备方法
摘要：	本发明公开了一种羊传染性胸膜肺炎间接ELISA检测诊断试剂制备方法，以羊传染性胸膜肺炎支原体菌株BNCC126187株(Mycoplasma ovipneumoniad)基因组DNA为模板，通过PCR扩增目的基因RPS11，将其克隆到pET28a(+)载体，成功构建了重组质粒pET28a‑RPS11，并转化至大肠杆菌Rosetta感受态细胞中，通过包涵体诱导表达重组RPS11蛋白并鉴定及纯化。本发明完成了RPS11蛋白的重组表达，制备出特异性较好的选择性免疫抗原，建立的间接ELISA检测方法为羊传染性胸膜肺炎的血清学检测诊断及流行病学调查提供了有效的技术手段。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	贵州;52
申请人：	贵州省畜牧兽医研究所
发明人：	文正常;王璇;潘淑惠;吴玙彤
专利状态：	有效
申请日期：	2019-01-30T00:00:00+0800
发布日期：	2019-05-21T00:00:00+0800
申请号：	CN201910092874.7
公开号：	CN109781973A
代理机构：	贵阳中新专利商标事务所
代理人：	李余江;程新敏
分类号：	G01N33/53(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	550005 贵州省贵阳市南明区小碧乡老里坡
主权项：	1.一种羊传染性胸膜肺炎间接ELISA检测诊断试剂制备方法，其特征在于：通过羊传染性胸膜肺炎支原体菌株全基因序列设计引物扩增目的基因RPS11进行克隆，构建重组质粒pET28a-RPS11，转化至大肠杆菌Rosetta感受态细胞中，并通过包涵体诱导表达重组RPS11蛋白并鉴定及纯化。 2.根据权利要求1所述的羊传染性胸膜肺炎间接ELISA检测诊断试剂制备方法，其特征在于引物设计与合成方法是：利用primer 5.0软件，根据Genebank中的基因序列，对ribosomal protein S11[Mycoplasma ovipneumoniae NM2010]基因序列设计引物： RPS11-F：5’-GGATCCATGGCAACTAATACTCGT-3’； RPS11-R：5’-CTCGAGCCTTTTTTCCTGACG-3’。 3.根据权利要求2所述的羊传染性胸膜肺炎间接ELISA检测诊断试剂制备方法，其特征在于PCR产物扩增方法是：按照细菌DNA基因组提取试剂盒说明书提取GM01株的基因组DNA；以提取的DNA为模版，PCR采用50μL反应体系：ddH2O 25μL，2×PCR mix 20μL，基因组DNA模板4μL，上、下游引物各1μL；反应条件：95℃预变性5min，95℃变性15s，55℃退火30s，72℃延伸1min，25个循环，最后72℃延伸10min。 4.根据权利要求2所述的羊传染性胸膜肺炎间接ELISA检测诊断试剂制备方法，其特征在于载体与目的基因酶切和连接方法是：将测序正确的目的基因PCR产物及pET28a(+)质粒于37℃水浴锅分别用BamHI、XhoI同时进行双酶切，孵育1～2h，使用胶回收试剂盒分别回收目的片段和载体片段。 5.根据权利要求2所述的羊传染性胸膜肺炎间接ELISA检测诊断试剂制备方法，其特征在于所述重组质粒载体的构建与鉴定包括：重组质粒构建：将要转化的DNA片段加入到装有TOP10感受态细胞的管中，混匀内容物，冰浴30min；离心管混合物放入加温至42℃的循环水中，热激90s，快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却1～2min；每管加入200μL SOC液体培养基，用水浴将培养基加温至37℃，然后将管转移到设置为37℃的摇床上，220rpm培养45min，使细胞复苏并表达质粒编码的抗性标记基因；将已转化的感受态细胞转移到含有kana抗生素的LB培养基上增殖培养；倒置平板，于37℃培养，直至12～16h后出现菌斑； DNA酶切与扩增检测：用BamHI和XhoI两种酶酶切重组质粒，回收目的基因；用酶切回收质粒pET28a(+)，使用T4 DNA Ligase回收链接双酶切后的质粒目的DNA，于16℃水浴锅孵育0.5～1h；将链接后的产物转化至大肠杆菌TOP10感受态细胞，并涂布于LB固体平板，37℃过夜培养；待平板长出菌落，随机挑取若干个单个菌落，进行菌落PCR验证，检测转化子。
所属类别：	发明专利