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原文传递定量检测抗虫蛋白Cry2A的酶联免疫试剂盒

专利名称：	定量检测抗虫蛋白Cry2A的酶联免疫试剂盒
摘要：	本发明公开了一种定量检测转基因水稻中抗虫蛋白Cry2A的酶联免疫试剂盒及其检测方法。所述酶联免疫试剂盒由包被捕获抗体的微孔反应板、样品处理液、生物素标记的检测抗体、标准品、辣根过氧化物酶标记的亲和素、生物素标记的抗体稀释液、辣根过氧化物酶标记的亲和素稀释液、浓缩洗涤液、底物溶液、终止液和板贴组成。本发明的检测方法具有操作简便、能同时快速检测大批样品，具有高灵敏度、高特异性的特点。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	北京;11
申请人：	中国农业科学院生物技术研究所
发明人：	刘卫晓;金芜军;董美;高进;张哲
专利状态：	有效
申请日期：	2019-03-18T00:00:00+0800
发布日期：	2019-07-16T00:00:00+0800
申请号：	CN201910201069.3
公开号：	CN110018310A
代理机构：	北京华仲龙腾专利代理事务所(普通合伙)
代理人：	李静
分类号：	G01N33/68(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	100081 北京市海淀区中关村南大街12号
主权项：	1.一种定量检测转基因水稻中抗虫蛋白Cry2A的酶联免疫试剂盒，其特征在于，所述酶联免疫试剂盒包括包被捕获抗体的微孔反应板，所述捕获抗体由保藏号为CGMCC No.16696的杂交瘤细胞株1D11-1A5分泌得到，或者由保藏号为CGMCC No.16695的杂交瘤细胞株2G4-1B8分泌得到。 2.根据权利要求1所述定量检测转基因水稻中抗虫蛋白Cry2A的酶联免疫试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括样品处理液、生物素标记的检测抗体、标准品、辣根过氧化物酶标记的亲和素、生物素标记的抗体稀释液、辣根过氧化物酶标记的亲和素稀释液、浓缩洗涤液、底物溶液、终止液和板贴。 3.根据权利要求2所述定量检测转基因水稻中抗虫蛋白Cry2A的酶联免疫试剂盒，其特征在于，所述样品处理液的配方为：1M Tris,pH 7.5 500uL，1M NaCL 1.5mL，0.5M EDTA 20uL，50％甘油2mL，10％SDS 1mL，用双蒸水配成10ML，使用时添加1片蛋白酶抑制剂以及50uL的1mM苯甲基磺酰氟；所述生物素标记的检测抗体为100μg/mL生物素标记的Cry2A 2G4-1B8鼠单抗(PBS,50％甘油)溶液；所述标准品为100ng的His-Cry2A重组蛋白；所述辣根过氧化物酶标记的亲和素为1:40辣根过氧化物酶标记的亲和素溶液；所述生物素标记的抗体稀释液以及辣根过氧化物酶标记的亲和素稀释液配方为1％BSA 1g，0.05％的吐温20 0.05mL，0.1％的NaN3 0.1mL，最终用1×PBS定容至100mL；所述浓缩洗涤液为含有1.0％Tween-20的10×PBS；所述底物溶液为0.5mL 2mg/mL TMB无水乙醇溶液，10mL底物缓冲液，32μL 30％H2O2混合，现用现配；所述终止液为1M H2SO4。 4.一种定量检测转基因水稻中抗虫蛋白Cry2A的酶联免疫检测方法，其特征在于，包括以下步骤： 1)将样品处理液、生物素标记的检测抗体、标准品、辣根过氧化物酶标记的亲和素、生物素标记的抗体稀释液、辣根过氧化物酶标记的亲和素稀释液、浓缩洗涤液、底物溶液、终止液置于18-25℃，平衡至少30分钟； 2)分别设标准品孔、待测样本孔，在每孔中加入标准品或待测样本进行温育，然后弃去液体，甩干后加入生物素标记的检测抗体工作液进行温育，弃去孔内液体，洗涤甩干后每孔加入辣根过氧化物酶标记的亲和素工作液，进行温育，弃去孔内液体，洗涤甩干后每孔加入底物溶液，避光显色后每孔加入终止溶液，混匀在反应终止后5分钟内用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度OD值； 3)数据处理：将标准品及样本值减去S0孔数值后绘制曲线，如果设置复孔，则取其平均值计算，以标准品的浓度为纵坐标，OD值为横坐标，绘出标准曲线，根据样本OD值，由标准曲线查出相应的浓度。 5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，生物素标记的检测抗体工作液是通过将生物素标记的检测抗体液用生物素标记的抗体稀释液按1:100倍进行稀释得到的。 6.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，辣根过氧化物酶标记的亲和素工作液是通过将辣根过氧化物酶标记的亲和素用辣根过氧化物酶标记的亲和素稀释液按1:100倍进行稀释得到的。 7.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，在步骤2)中，每孔分别加标准品或待测样本80-120μL，轻轻晃动混匀，覆上板贴，37℃温育1.5-2.5小时；弃去液体，甩干，不用洗涤；每孔加生物素标记抗体工作液80-120μL，覆上新的板贴，37℃温育0.5-1.5小时；弃去孔内液体，甩干，洗板2-4次，每次浸泡1-3分钟，150-250μL/每孔，甩干；每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液80-120μL，覆上新的板贴，37℃温育0.5-1.5小时；弃去孔内液体，甩干，洗板4-6次，每次浸泡1-3分钟，150-250μL/每孔，甩干；依序每孔加底物溶液90μL，37℃避光显色15-30分钟；依序每孔加终止溶液50μL，终止反应。 8.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，在步骤2)中，每孔分别加标准品或待测样本100μL，轻轻晃动混匀，覆上板贴，37℃温育2小时；弃去液体，甩干，不用洗涤；每孔加生物素标记抗体工作液100μL，覆上新的板贴，37℃温育1小时；弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡2分钟，200μL/每孔，甩干；每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液100μL，覆上新的板贴，37℃温育1小时；弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡2分钟，200μL/每孔，甩干；依序每孔加底物溶液90μL。 9.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法为ELISA双抗体夹心方法。
所属类别：	发明专利