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原文传递一种定量检测抗除草剂蛋白Bar的酶联免疫试剂盒

专利名称：	一种定量检测抗除草剂蛋白Bar的酶联免疫试剂盒
摘要：	本发明公开了属于生物工程技术领域的一种定量检测转基因水稻中抗除草剂蛋白Bar的酶联免疫试剂盒及其检测方法，所述酶联免疫试剂盒由包被捕获抗体的微孔反应板、样品处理液、生物素标记的检测抗体、标准品、辣根过氧化物酶标记的亲和素、生物素标记的抗体稀释液、辣根过氧化物酶标记的亲和素稀释液、浓缩洗涤液、底物溶液、终止液和板贴组成，本发明试剂盒成本低，主要试剂均以工作液形式提供，操作简便，能同时快速检测大批样品；具有高灵敏度、高特异性的特点；是目前国内乃至国际首个能定量特异检测转基因水稻中抗除草剂蛋白Bar的试剂盒。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	北京;11
申请人：	中国农业科学院生物技术研究所
发明人：	刘卫晓;张哲;金芜军;高进;董美;王迪;苗朝华
专利状态：	有效
申请日期：	2019-06-04T00:00:00+0800
发布日期：	2019-09-10T00:00:00+0800
申请号：	CN201910482615.5
公开号：	CN110221078A
代理机构：	北京成实知识产权代理有限公司
代理人：	叶立涛
分类号：	G01N33/68(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	100081 北京市海淀区中关村南大街12号
主权项：	1.一种定量检测转基因水稻中抗除草剂蛋白Bar的酶联免疫试剂盒，其特征在于，所述酶联免疫试剂盒由包被捕获抗体的微孔反应板、样品处理液、生物素标记的检测抗体、标准品、辣根过氧化物酶标记的亲和素、生物素标记的抗体稀释液、辣根过氧化物酶标记的亲和素稀释液、浓缩洗涤液、底物溶液、终止液和板贴组成；其中，样品处理液为：1M Tris,pH 7.5 500uL，1M NaCL 1.5mL，0.5M EDTA 20uL，50％甘油2mL，10％SDS 1mL，用双蒸水配成10ML，使用时添加1片蛋白酶抑制剂以及50uL的1mM苯甲基磺酰氟；生物素标记的检测抗体为100μg/mL生物素标记的Bar单抗杂交瘤细胞株PA1-18030030/1B8 3D6鼠单抗(PBS,50％甘油)溶液；标准品为100ng的His-Bar重组蛋白；辣根过氧化物酶标记的亲和素为1:40辣根过氧化物酶标记的亲和素溶液；生物素标记的抗体稀释液以及辣根过氧化物酶标记的亲和素稀释液配方为1％BSA1g，0.05％的吐温20 0.05mL，0.1％的NaN3 0.1mL，最终用1×PBS定容至100mL；浓缩洗涤液为含有1.0％Tween-20的10×PBS；底物溶液为0.5mL 2mg/mL TMB无水乙醇溶液，10mL底物缓冲液，32μL 30％H2O2混合，现用现配；终止液为1M H2SO4。 2.根据权利要求1所述定量检测转基因水稻中抗除草剂蛋白Bar的酶联免疫试剂盒，其特征在于，所述的捕获抗体由保藏号为CGMCC No.17084的Bar单抗杂交瘤细胞株PA1-18030030/6F5 1D2分泌得到的，捕获抗体的检测范围1.5625ng/mL-100ng/mL。 3.根据权利要求1所述定量检测转基因水稻中抗除草剂蛋白Bar的酶联免疫试剂盒，其特征在于，所述检测抗体由保藏号为CGMCC No.17083的Bar单抗杂交瘤细胞株PA1-18030030/1B8 3D6分泌得到。 4.根据权利要求1所述定量检测转基因水稻中抗除草剂蛋白Bar的酶联免疫试剂盒，其特征在于，所述His-Bar重组蛋白是通过将Bar编码基因进行扩增、测序，鉴定正确以后与pET28a质粒连接，将重组表达载体pET28a-Bar转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，保存的重组蛋白Bar表达菌株复苏培养，用IPTG于16℃过夜诱导表达蛋白，并通过重组蛋白纯化得到。 5.根据权利要求2、3所述定量检测转基因水稻中抗除草剂蛋白Bar的酶联免疫试剂盒，其特征在于，所述Bar单抗杂交瘤细胞株PA1-18030030/6F5 1D2和Bar单抗杂交瘤细胞株PA1-18030030/1B8 3D6是用原核表达的重组蛋白Bar免疫BALB/c小鼠，然后用免疫后的小鼠脾细胞与商品化的小鼠杂交瘤细胞SP2/0融合，用HAT培养基筛选得到。 6.权利要求1-5所述定量检测转基因水稻中抗除草剂蛋白Bar的酶联免疫试剂盒的检测方法，其特征在于，包括以下步骤： 1)将权利要求1所述的样品处理液、生物素标记的检测抗体、标准品、辣根过氧化物酶标记的亲和素、生物素标记的抗体稀释液、辣根过氧化物酶标记的亲和素稀释液、浓缩洗涤液、底物溶液、终止液置于18-25℃，平衡至少30分钟； 2)分别设标准品孔、待测样本孔，在对应孔中加入标准品和待测样本进行温育，然后弃去液体，甩干；每孔加入生物素标记的检测抗体工作液进行温育，弃去孔内液体，甩干，洗板，甩干；每孔加入辣根过氧化物酶标记的亲和素工作液，进行温育，弃去孔内液体，甩干，洗板，甩干；每孔加入底物溶液，避光显色后每孔加入终止溶液，在反应终止后5分钟内用酶标仪在450nm波长依序测量各孔的光密度OD值； 3)数据处理：将标准品及样本值减去S0孔数值后绘制曲线，如果设置复孔，则取其平均值计算，以标准品的浓度为纵坐标，OD值为横坐标，绘出标准曲线，根据样本OD值，由标准曲线查出相应的浓度。 7.根据权利要求6所述定量检测转基因水稻中抗除草剂蛋白Bar的酶联免疫试剂盒的检测方法，其特征在于，所述生物素标记的检测抗体工作液是通过将生物素标记的检测抗体用生物素标记的抗体稀释液按1:100倍进行稀释得到的；所述辣根过氧化物酶标记的亲和素工作液是通过将辣根过氧化物酶标记的亲和素用辣根过氧化物酶标记的亲和素稀释液按1:100倍进行稀释得到的。 8.根据权利要求6所述定量检测转基因水稻中抗除草剂蛋白Bar的酶联免疫试剂盒的检测方法，其特征在于，所述步骤2)中，每孔加标准品或待测样本80-120μL，轻轻晃动混匀，覆上板贴，37℃温育1.5-2.5小时；弃去液体，甩干，不用洗涤；每孔加生物素标记抗体工作液80-120μL，覆上新的板贴，37℃温育0.5-1.5小时；弃去孔内液体，甩干，洗板2-4次，每次浸泡1-3分钟，150-250μL/每孔，甩干；每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液80-120μL，覆上新的板贴，37℃温育0.5-1.5小时；弃去孔内液体，甩干，洗板4-6次，每次浸泡1-3分钟，150-250μL/每孔，甩干；依序每孔加底物溶液90μL，37℃避光显色15-30分钟；依序每孔加终止溶液50μL，终止反应。 9.根据权利要求6所述定量检测转基因水稻中抗除草剂蛋白Bar的酶联免疫试剂盒的检测方法，其特征在于，所述步骤2)中，每孔加标准品或待测样本100μL，轻轻晃动混匀，覆上板贴，37℃温育2小时；弃去液体，甩干，不用洗涤；每孔加生物素标记抗体工作液100μL，覆上新的板贴，37℃温育1小时；弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡2分钟，200μL/每孔，甩干；每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液100μL，覆上新的板贴，37℃温育1小时；弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡2分钟，200μL/每孔，甩干；依序每孔加底物溶液90μL，终止反应。 10.权利要求1-5所述定量检测转基因水稻中抗除草剂蛋白Bar的酶联免疫试剂盒的检测方法，其特征在于，所述检测方法为ELISA双抗体夹心方法。
所属类别：	发明专利