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原文传递制备活的微生物样品和微生物用于随后的质谱测量和评估

专利名称：	制备活的微生物样品和微生物用于随后的质谱测量和评估
摘要：	本发明涉及一种制备活的微生物样品和微生物用于随后的质谱测量和评估的方法。可以从这种测量得出的结果可以特别地用于根据物种/亚种更快地识别微生物样品中的微生物和/或快速确定微生物对抗微生物物质的抗性/敏感性和/或微生物的进一步特征；例如，在致病性，毒力和代谢方面的特征。根据本发明的优选实施形式，制备特别直接在质谱样品载体上进行。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	德国;DE
申请人：	布鲁克道尔顿有限公司
发明人：	叶夫根尼·艾德莱维希;卡斯滕·贝克尔
专利状态：	有效
申请日期：	2016-11-30T00:00:00+0800
发布日期：	2019-07-16T00:00:00+0800
申请号：	CN201680091260.1
公开号：	CN110023761A
代理机构：	北京天昊联合知识产权代理有限公司
代理人：	张凯;张杰
分类号：	G01N33/68(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	德国不来梅
主权项：	1.制备用于随后的质谱测量的、活的微生物样品的方法，所述方法包括以下步骤： (a)提供含有多个样品点的扁平样品载体； (b)在至少一个样品点上施加存在于营养介质液滴中的至少一个活的微生物样本； (c)将样品载体置于具有所定义气氛的孵育室中预定的一段时间，以刺激微生物的生长； (d)在预定的一段时间后从营养介质液滴中除去残留液体，以在样品点上暴露微生物沉积物； (e)准备用于解吸电离的样品点； (f)将样品载体转移到质谱仪的解吸离子源中，从制备的样品点产生离子并获得至少一个相应的质谱；以及 (g)将获得的质谱与参考数据集进行比较，以确定微生物样品的至少一种特征。 2.根据权利要求1所述的方法，在所述方法中参考数据集包括参考谱，所述参考谱取自先前获得的质谱库，其中，在鉴定过程中，步骤(g)的至少一个特征包括微生物样品中微生物的物种或亚种。 3.根据权利要求1或2所述的方法，在所述方法中，在步骤(b)中将相同的微生物样品平行施加到几个样品点，其中营养介质的液滴有的含有抗微生物物质，有的则不含。 4.根据权利要求3所述的方法，在所述方法中，具有抗微生物物质的几个营养介质液滴有的含有酶抑制剂，有的不含。 5.根据权利要求4所述的方法，在所述方法中，β-内酰胺酶抑制剂用作酶抑制剂。 6.根据权利要求3至5中任意一项所述的方法，在所述方法中，参考数据集是最近获得的样品点质谱，所述样品点上在步骤(b)中已经施加了没有任何抗微生物物质或酶抑制剂的营养介质液滴，并且，在表征的过程中，步骤(g)中的至少一个特性包括微生物样品中的微生物对抗微生物物质或抗微生物物质和酶抑制剂的组合的敏感性。 7.根据权利要求6所述的方法，在所述方法中，在步骤中(b)中施加几滴分别具有不同浓度的抗微生物物质的营养介质，并且在进行表征时，步骤(g)中的至少一个特征包括抗微生物物质对于微生物的最小抑制浓度。 8.根据权利要求3至7中任意一项所述的方法，在所述方法中，从微生物生长的差异中导出步骤(g)中的至少一个特征。 9.根据权利要求3至8中任意一项所述的方法，在所述方法中，步骤(b)中的微生物样品在营养介质的液滴中这样定量，使得量略低于质谱测量的检测极限。 10.根据权利要求1至9中任意一项所述的方法，在所述方法中，步骤(c)中孵育室中的温度和湿度分别设定为约36℃和接近饱和。 11.根据权利要求1至10中任意一项所述的方法，在所述方法中，步骤(d)中残留液体的去除包括用吸收材料轻轻擦掉液滴上清液或将其移液。 12.根据权利要求1至11中任意一项所述的方法，在所述方法中，步骤(e)中的制备包括从微生物沉积物中预备提取微生物蛋白质/肽，和/或洗涤微生物沉积物，和/或将微生物沉积物嵌入激光吸收基质物质中从而随后在步骤(f)中通过基质辅助激光解吸(MALDI)进行电离。 13.根据权利要求1至12中任意一项所述的方法，在所述方法中，步骤(f)中的质谱是飞行时间分散获得的。 14.根据权利要求1至13中任意一项所述的方法，在所述方法中，微生物样品在步骤(b)中，(i)作为至少一个样品点上的营养介质液滴中的悬浮物分配，或者(ii)首先以细胞形式沉积在至少一个样品点上，然后浸入分撒的营养介质液滴中。 15.用于随后的质谱测量的微生物的制备方法，所述方法包括以下步骤： (a)提供含有若干样品点的扁平样品载体； (b)将完整的、在离开样品载体处培养和/或分离的微生物在营养介质液滴中施加到平坦样品载体的至少一个样品点上； (c)将扁平样品载体保持预定的静置时间，以允许在样品点上形成微生物沉积物； (d)在预定的静置时间后，除去营养介质液滴的残留液体，以暴露微生物的沉积物； (e)准备样品点以进行解吸电离； (f)将样品载体转移到质谱仪的解吸离子源中，从经制备的样品点产生离子并获得至少一个相应的质谱；以及 (g)将获得的质谱与参考数据集进行比较，以确定微生物的至少一个特征。 16.根据权利要求15所述的方法，在所述方法中，参考数据集具有参考谱，所述参考谱取自先前获得的质谱库，并且在鉴定过程中，步骤(g)中的至少一种特征包括微生物的物种或亚种。 17.根据权利要求15或16所述的方法，在所述方法中，在步骤(b)中施加之前，微生物可以在液体营养介质中在远离扁平样品载体的至少一个容器中培养，并由此处转移到样品点上。 18.根据权利要求17所述的方法，在所述方法中，在几个容器中培养相同的微生物，并且有的液体营养介质中添加有抗微生物物质，有的液体营养介质中不添加抗微生物物质。 19.根据权利要求18所述的方法，在所述方法中，不同容器的液体营养介质中有的添加有酶抑制剂，有的不添加酶抑制剂。 20.根据权利要求19所述的方法，在所述方法中，β-内酰胺酶抑制剂作为酶抑制剂添加。 21.根据权利要求18至20中任意一项所述的方法，在所述方法中，参考数据集是最近获得的样品点质谱，所述样品点上存在微生物沉积物，所述微生物沉积物源自不含抗微生物物质或酶抑制剂的液体营养介质，并且在进行表征时，步骤(g)中的至少一个特征包括微生物对于抗微生物物质的敏感性或对于抗微生物物质和酶抑制剂的组合的敏感性。 22.根据权利要求21所述的方法，在所述方法中，相同的微生物在分别具有不同浓度的液体营养介质的不同容器中培养，并且在进行表征时，步骤(g)中的至少一个特征可以包括抗微生物物质对于微生物的最小抑制浓度。 23.根据权利要求18至22中任意一项所述的方法，在所述方法中，步骤(g)中的至少一个特征由微生物生长的差异导出。 24.根据权利要求17至23中任意一项所述的方法，在所述方法中，在培养开始时，对微生物进行定量，使得其量略低于质谱测量的检测极限。 25.根据权利要求15至24中任意一项所述的方法，在所述方法中，步骤(c)中的预定静止时间为10至60分钟之间。 26.根据权利要求15至25中任意一项所述的方法，在所述方法中，在步骤(d)中从扁平样品载体中除去残余液体包括用吸收性材料擦掉液滴上清液或将其移液。 27.根据权利要求15至26中任意一项所述的方法，在所述方法中，步骤(e)中的制备包括从扁平样品载体上的微生物沉积物中准备性提取微生物蛋白质/肽和/或洗涤微生物沉积物和/或将微生物沉积物嵌入激光吸收基质物质中，以便随后在步骤(f)中通过基质辅助激光解吸(MALDI)电离。 28.根据权利要求15至27中任意一项所述的方法，在所述方法中，步骤(f)中的质谱通过飞行时间分散获得。 29.根据权利要求17至28中任意一项所述的方法，在所述方法中，微生物：(i)作为液体营养介质中的悬浮液分配到容器中，或者(ii)首先以细胞形式引入容器中，之后灌入液体营养介质。 30.根据权利要求17至29中任意一项所述的方法，在所述方法中，微量滴定板中的孔用作容器。 31.根据权利要求17至30中任意一项所述的方法，在所述方法中，来自步骤(a)的样品载体板分成具有平坦样品点的第一平坦区段和在表面上具有凹陷的第二区段，其中这些凹陷用作容器，并且在步骤(b)中将在其中生长的完整微生物从此处转移到第一平坦区段中的平坦样品点上。
所属类别：	发明专利