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原文传递用于识别微生物的质谱方法和试剂盒

专利名称：	用于识别微生物的质谱方法和试剂盒
摘要：	本发明包含一种用于识别样品中的微生物的新颖方法和系统，所述样品包含可能干扰对所述微生物的识别的来自非微生物来源的蛋白质和其它生物材料(例如，来源于哺乳动物的蛋白质)。本文所述的方法和系统包含在质谱分析之前使用一次性色谱介质来纯化完整蛋白质。本文所述的色谱介质和方法可以快速且高效地从粗细胞裂解物中去除大部分干扰生物材料(例如，哺乳动物蛋白)，同时保持高信号强度并去除足够的一种或多种干扰蛋白以允许通过质谱分析来识别一种或多种微生物。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	芬兰;FI
申请人：	赛默飞世尔科学有限公司
发明人：	M·科斯吉奈恩;L·瓦尔姆;J·兰尼斯托;K·弗鲁克;R·格里斯特;A·兰塔卡利
专利状态：	有效
申请日期：	2017-08-24T00:00:00+0800
发布日期：	2019-06-25T00:00:00+0800
申请号：	CN201780064137.5
公开号：	CN109937363A
代理机构：	中国国际贸易促进委员会专利商标事务所
代理人：	刘晓东
分类号：	G01N33/569(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	芬兰万塔
主权项：	1.一种用于识别流体中的微生物的方法，所述流体包括来自哺乳动物来源的干扰蛋白，所述方法包括：制备裂解物，所述裂解物包括所述干扰蛋白和来自所述微生物的蛋白质；使所述裂解物与色谱介质接触，其中所述干扰蛋白和来自所述微生物的所述蛋白质结合到所述色谱介质；选择性地洗脱结合到所述色谱介质的蛋白质以产生至少一种经过洗脱的级分，其中来自所述微生物的所述蛋白质中富集了所述至少一种经过洗脱的级分并且所述干扰蛋白中缺少所述至少一种经过洗脱的级分；以及使所述至少一种经过洗脱的级分经历蛋白质质谱分析以识别所述流体中一种或多种微生物的存在。 2.根据权利要求1所述的方法，其中所述流体是血液、血液培养物、尿液或脑脊髓液之一。 3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述干扰蛋白包含血红蛋白、防御素或其蛋白水解产物中的一种或多种。 4.根据权利要求1所述的方法，其中制备所述裂解物包含：裂解所述微生物的细胞以释放其内容物。 5.根据权利要求4所述的方法，其进一步包括：将细胞片段和未裂解的微生物细胞与所述微生物细胞的所述内容物分离以产生所述裂解物。 6.根据权利要求5所述的方法，其进一步包括：提供所述流体；使所述流体与被选择用于裂解所述流体中的哺乳动物细胞而不是所述微生物的细胞的裂解剂接触；将所述微生物的所述细胞与经过裂解的哺乳动物细胞分离；洗涤所述微生物的所述细胞。 7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中使所述裂解物与色谱介质接触包含：提供其中具有所选量的所述色谱介质的容器；将所述裂解物加入所述容器并且使所述裂解物与所述色谱介质混合；通过离心集结所述色谱介质以将所述色谱介质与所述裂解物分离；在洗涤缓冲液介质中洗涤所述色谱介质；以及集结所述色谱介质以将所述色谱介质与所述洗涤缓冲液分离；并且其中选择性地洗脱结合到所述色谱介质的蛋白质是用洗脱缓冲液执行的。 8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中使所述裂解物与色谱介质接触包含：提供含有由所述色谱介质构成的层的提取盒；将所述裂解物加入所述提取盒并且使所述裂解物流过所述色谱介质层；以及将洗涤缓冲液加入所述提取盒并且使所述洗涤缓冲液流过所述色谱介质层；并且其中选择性地洗脱结合到所述色谱介质的蛋白质是用洗脱缓冲液执行的。 9.根据权利要求6所述的方法，其中所述提取盒在液相色谱系统中是内联的，并且所述裂解物是通过泵加入所述提取盒的。 10.根据权利要求8或9所述的方法，其中所述洗脱缓冲液包括水和范围为10vol％到60vol％的乙腈。 11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中蛋白质质谱分析是MALDI或ESI-MS之一。 12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述色谱介质选自由以下组成的组：反相介质、正相介质、离子交换介质、亲和色谱介质、尺寸排阻介质、疏水相互作用介质和其组合。 13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述色谱介质由以下制备：选自由以下组成的组的单体：含经取代或未经取代的乙烯基的单体、含经取代或未经取代的丙烯酸酯的单体、含经取代或未经取代的甲基丙烯酸酯的单体、丙烯酰胺、经氟取代的乙烯；选自由以下组成的组的聚合物：聚烯烃、聚酯、聚氨酯、聚酰胺；和其组合。 14.根据权利要求11所述的方法，其中所述单体包含至少两种单体的混合物，所述单体以10vol.％到70vol.％的量存在。 15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述色谱介质由以下中的任何两种或更多种的混合物制备：二乙烯基苯、苯乙烯和乙基乙烯基苯。 16.一种用于识别流体中的微生物的方法，所述流体包括干扰哺乳动物蛋白和来自所述微生物的蛋白质，所述方法包括：制备裂解物，所述裂解物包含所述流体中的所述干扰哺乳动物蛋白和来自所述微生物的所述蛋白质，其中所述流体选自由以下组成的组：全血、血液培养物、尿液和脑脊髓液，其中制备所述裂解物包含：裂解所述微生物的细胞以释放其内容物，所述内容物包括来自微生物的蛋白质；将来自所述微生物的所述蛋白质与所述干扰哺乳动物蛋白分离，其中所述分离包含以下步骤： (a)提供一次性提取盒，所述提取盒含有色谱介质层； (b)将所述裂解物加入所述提取盒并且使所述裂解物流过所述色谱介质层； (c)用洗涤缓冲液洗涤所述提取盒；以及 (d)选择性地洗脱结合到所述色谱介质的蛋白质以产生至少一种经过洗脱的级分，其中所述选择性地洗脱包含：流动不同浓度的洗脱缓冲液，所述洗脱缓冲液包含浓度范围为10vol％到60vol％的极性有机溶剂；以及使所述至少一种经过洗脱的级分经历蛋白质质谱分析以识别血液样品中一种或多种感染物的存在。 17.根据权利要求16所述的方法，其中所述微生物是以下中的一种或多种：革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌、古细菌、分枝杆菌、支原体、酵母、病毒和丝状真菌。 18.根据权利要求16所述的方法，其进一步包括：将未裂解的微生物细胞和细胞片段与所述微生物细胞的所述内容物分离以产生所述裂解物。 19.根据权利要求16所述的方法，其进一步包括以下步骤：如果所述流体中存在哺乳动物细胞，则通过使所述哺乳动物细胞与被选择用于裂解所述哺乳动物细胞而不是所述微生物的所述细胞的裂解剂接触，从而裂解所述哺乳动物细胞；将所述微生物的所述细胞与经过裂解的哺乳动物细胞分离；以及洗涤所述微生物的所述细胞。 20.根据权利要求19所述的方法，其中被选择用于裂解所述哺乳动物细胞的所述裂解剂是洗涤剂。 21.根据权利要求20所述的方法，其中所述洗涤剂是皂苷。 22.根据权利要求16所述的方法，其中所述提取盒在液相色谱系统中是内联的，并且所述裂解物是通过泵加入所述提取盒的。 23.根据权利要求16所述的方法，其中所述洗脱缓冲液包括水和10vol％到60vol％的乙腈。 24.根据权利要求23所述的方法，其中所述提取盒上的所述蛋白质被等度洗脱。 25.根据权利要求23所述的方法，其中所述提取盒上的所述蛋白质以约10vol％到60vol％乙腈的梯度洗脱。 26.根据前述权利要求16到25中任一项所述的方法，其中蛋白质质谱分析是MALDI、ESI-MS、或ESI-MS/MS之一。 27.一种用于识别流体样品中的微生物的试剂盒，其包括：样品裂解管，其包括被选择用于选择性地裂解所述样品中的哺乳动物细胞而不是待识别的所述微生物的细胞的洗涤剂；微生物裂解缓冲液；一次性提取盒，其包括用于快速且选择性地将哺乳动物蛋白与微生物蛋白分离的色谱介质；以及识别流体中的所述微生物的说明书，其用于通过以下来实现：裂解体液中的哺乳动物细胞；裂解所述微生物的细胞；使用所述提取盒将所述微生物的蛋白质与哺乳动物蛋白分离；以及通过使所述微生物的蛋白质经历质谱分析来识别所述微生物。 28.根据权利要求27所述的试剂盒，其进一步包括被选择用于将至少一种经过洗脱的级分从所述提取盒洗脱掉的洗脱缓冲液，所述至少一种经过洗脱的级分包括足以识别所述微生物的微生物蛋白。 29.根据权利要求27或28所述的试剂盒，其中所述色谱介质选自由以下组成的组：离子交换介质、亲和色谱介质、尺寸排阻介质、疏水相互作用介质和其组合。 30.根据权利要求27、28或29所述的试剂盒，其中所述色谱介质由以下制备：选自由以下组成的组的单体：含经取代或未经取代的乙烯基的单体、含经取代或未经取代的丙烯酸酯的单体、含经取代或未经取代的甲基丙烯酸酯的单体；丙烯酰胺；聚烯烃；聚酯；聚氨酯、聚酰胺；经氟取代的乙烯；和其组合。 31.根据权利要求30所述的试剂盒，其中所述单体包含至少两种单体的混合物，所述单体以10vol.％到70vol.％的量存在。 32.根据权利要求30所述的试剂盒，其中所述色谱介质由二乙烯基苯和乙基乙烯基苯的混合物制备。 33.根据权利要求27到32中任一项所述的试剂盒，其中蛋白质质谱分析是MALDI或ESI-MS之一。
所属类别：	发明专利