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原文传递一种橘青霉发酵液中淀粉酶酶活力的检测方法

专利名称：	一种橘青霉发酵液中淀粉酶酶活力的检测方法
摘要：	本发明公开了橘青霉发酵液中淀粉酶酶活力的检测方法，本发明使用DNS还原显色的方法检测橘青霉发酵液中还原糖的含量，本发明在DNS比色法的基础上，加入碘液指示剂，依据蓝色消失判断淀粉被淀粉酶完全分解，避免了传统滴定终点颜色判断失误的发生，进一步提高了检测结果的准确性。同时本发明还确定了橘青霉发酵液中淀粉酶的最佳酶解温度和最适DNS溶液添加量的选择，有力的确保工业化测定数值的准确性和测定方法应用的可行性，本发明检测淀粉酶活力的方法测定线性范围广，重复性好，适合工业和临床应用。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	江苏;32
申请人：	南京同凯兆业生物技术有限责任公司
发明人：	陈海波;陈晓春;张磊;蔡家栋
专利状态：	有效
申请日期：	2019-04-23T00:00:00+0800
发布日期：	2019-07-16T00:00:00+0800
申请号：	CN201910329902.2
公开号：	CN110018158A
代理机构：	南京苏高专利商标事务所(普通合伙)
代理人：	丁静静;肖明芳
分类号：	G01N21/78(2006.01);G;G01;G01N;G01N21
申请人地址：	211806 江苏省南京市浦口区双峰路8号
主权项：	1.一种橘青霉发酵液中淀粉酶酶活力的检测方法，其特征在于，包括如下步骤： (1)取质量分数为1％的淀粉悬浮液1.0ml加入到25ml定量瓶中，添加pH为5.6柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液2ml，55℃预热10min； (2)取1ml待测橘青霉发酵液于试管中，于55℃水浴中预热10min； (3)将步骤(1)预热的淀粉缓冲液与步骤(2)预热的淀粉酶液混合反应，反应55℃反应30min后，加入碘液指示剂，直至蓝色消失，加入2.5～3ml DNS显色试剂，在100℃沸水浴中反应10min后，加入1.0ml4％NaOH溶液终止反应； (4)迅速冷却至室温，取适量反应液定容后，使用紫外分光光度测出520nm处吸光度的数值； (5)设置空白对照：操作同步骤(1)～(4)，只是在步骤(2)中不加所述的橘青霉酶液，以去离子水代替；按下式计算橘青霉发酵液中淀粉酶的活力：每1ml橘青霉发酵液含淀粉酶活力U＝KN(A—B)/W*(X÷60)；式中： A为反应样品紫外光密度值在标准曲线上查的毫克数，mg； B为空白样品紫外光密度值在标准曲线上查的毫克数，mg； U为橘青霉发酵液淀粉酶活性，u/ml； W为橘青霉发酵液样品取样量，ml； K为还原糖标准曲线斜率； X为酶解反应时间X min； 60为1小时60min； N为稀释倍数，N＝稀释液体积V/25。 2.根据权利要求1所述橘青霉发酵液淀粉酶酶活力的检测方法，其特征在于，步骤(3)中，所述DNS显色试剂的配制方法如下：将6.3g3,5-二硝基水杨酸和262ml2mol/L NaOH溶液，加到500ml含有192g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g苯酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1000ml，贮于棕色瓶中一周后使用。 3.根据权利要求1所述橘青霉发酵液中淀粉酶酶活力的检测方法，其特征在于，所述葡萄糖标准曲线制作方法如下：取多支定量管编号，分别加入葡萄糖标准液、蒸馏水和3,5-二硝基水杨酸DNS试剂，配成不同葡萄糖含量的反应液；混合均匀后，在沸水浴中加热10min，取出，用冷水迅速冷却至室温，定容、摇匀、静置，使用紫外分光光度计测出520nm吸光度数值；以吸光度值为纵坐标，葡萄糖含量为横坐标，做出葡萄糖标准曲线。 4.根据权利要求3所述橘青霉发酵液淀粉酶酶活力的检测方法，其特征在于，所述葡萄糖标准液为1mg/mL。 5.根据权利要求1所述橘青霉发酵液淀粉酶酶活力的检测方法，其特征在于，所述pH为5.6柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液配制方法如下：称取柠檬酸20.00g，溶解后定容至1000mL为A液；称取柠檬酸钠29.41g，溶解后定容至1000mL为B液；取A液13.7mL与B液26.3mL混匀，即为pH为5.6柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。 6.根据权利要求1所述橘青霉发酵液淀粉酶酶活力的检测方法，其特征在于，步骤(1)中，所述淀粉悬浮液的配置方法如下：取经105℃干燥4小时的可溶性淀粉1.0g，加水20ml，搅匀后，边搅拌边添加5mol/LNaOH溶液0.2ml，使之完全溶解，加入1mol/L盐酸使溶液pH值为5.5，加水稀释至100ml。
所属类别：	发明专利