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原文传递一种人胎盘生长因子的检测试剂盒及其使用方法

专利名称：	一种人胎盘生长因子的检测试剂盒及其使用方法
摘要：	本发明公开了一种人胎盘生长因子的检测试剂盒。该试剂盒的主要包括特异性捕获抗体及特异性检测抗体；特异性捕获抗体及特异性检测抗体选自以下抗体：山羊多克隆抗体655170、小鼠单克隆抗体655565、山羊多克隆抗体446，且特异性捕获抗体与特异性检测抗体配对的种属来源应不同；本发明的试剂盒还包括固相载体、清洗液、增强液、标记物、校准品，以及实验缓冲液。本发明还提供了该检测试剂盒的使用方法。本发明检测试剂盒可用于检测人胎盘生长因子，具有操作简单、耗时短，准确性好、灵敏度高、线性范围宽、抗干扰性强、稳定性好等优点，在唐氏儿的辅助筛查以及不良妊娠反应的预测等方面具有良好的临床应用前景。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	广东;44
申请人：	广州市丰华生物工程有限公司
发明人：	谭玉华;王秀珍;胡爱武;沈健;李智强;廖三川;苏铭豪;汪勤
专利状态：	有效
申请日期：	2019-04-23T00:00:00+0800
发布日期：	2019-07-19T00:00:00+0800
申请号：	CN201910332813.3
公开号：	CN110031634A
代理机构：	广州三环专利商标代理有限公司
代理人：	宋静娜;郝传鑫
分类号：	G01N33/68(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	510000 广东省广州市开发区银谊街6号
主权项：	1.一种人胎盘生长因子的检测试剂盒，其特征在于，包括特异性捕获抗体以及特异性检测抗体；所述特异性捕获抗体及所述特异性检测抗体选自以下抗体：山羊多克隆抗体655170、小鼠单克隆抗体655565、山羊多克隆抗体446，且所述特异性捕获抗体与所述特异性检测抗体配对的种属来源应不同；所述小鼠单克隆抗体655565采用氨基酸序列为Ala21-Arg149(Genbank索取号为P49763)的大肠杆菌表达重组人PlGF，免疫小鼠所得；所述山羊多克隆抗体655170及山羊多克隆抗体446为采用氨基酸序列为Ala21-Arg149(Genbank索取号为CAA38698)的大肠杆菌表达重组人PlGF，免疫山羊所得。 2.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，还包括固相载体、标记物、校准品、清洗液、增强液，以及实验缓冲液；所述固相载体上包被有所述特异性捕获抗体或链霉亲和素；所述标记物为稀土元素与特异性检测抗体或链霉亲和素物形成特异性检测抗体标记物或链霉亲和素标记物；所述校准品为人重组胎盘生长因子经校准品稀释液按浓度梯度稀释而成。 3.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述稀土元素为铕。 4.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述校准品稀释液为50mmol/L，pH7.8的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液，含有5％的牛血清白蛋白、20ppm的硫柳汞，以及0.01％的叠氮钠。 5.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述清洗液为1.125g/L的氯化钠、0.02％(v/v)的吐温20、30ppm的300防腐剂的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液组成的混合物。 6.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述增强液为曲拉通、冰乙酸、螯合剂、纯化水组成的混合物。 7.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述实验缓冲液为由缓冲剂、防腐剂、免疫信号增强剂、蛋白质和螯合剂组成的混合溶液：所述缓冲剂为50mmol/L，pH 7.8的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液；所述防腐剂为含有0.02％(v/v)的300、20ppm的硫柳汞；所述螯合剂为0.001％(v/v)的乙二胺四乙酸二钠；所述免疫信号增强剂为5％～20％(v/v)的SignalBoostTM免疫信号增强剂、0.05％～0.2％(m/v)聚乙二醇6000中的一种或两种；所述蛋白质为0.1％(v/v)的小鼠血清、10％(v/v)的小牛血清、0.5％(m/v)的γ-牛球蛋白和5％(m/v)的牛血清白蛋白中的一种或几种。 8.根据权利要求1所述的检测试剂盒的使用方法，其特征在于，采用固相生物素亲和素法或桥式生物素亲和素法或三明治夹心法；所述固相生物素亲和素法，步骤如下： a)固相包被链霉亲和素，加入生物素标记的特异性捕获抗体反应， b)直接加入样本进行反应，洗涤后加入特异性检测抗体标记物反应，或洗涤后加入样本进行反应，洗涤后加入特异性检测抗体标记物反应，或直接同时加入样本和特异性检测抗体标记物反应，或洗涤后同时加入样本和特异性检测抗体标记物反应， c)洗涤后加入增强液，检测分析；所述桥式生物素亲和素法，步骤如下： a)固相包被特异性捕获抗体，加入样本进行反应， b)洗涤后加入生物素标记的特异性检测抗体反应，洗涤后加入链霉亲和素标记物反应，或洗涤后同时加入生物素标记特异性检测抗体、链霉亲和素标记物反应，或直接加入生物素标记特异性检测抗体反应，洗涤后加入链霉亲和素标记物反应，或直接同时加入生物素标记特异性检测抗体、链霉亲和素标记物反应； c)洗涤后加入增强液，检测分析；所述三明治夹心法，步骤如下： a)固相包被特异性捕获抗体， b)加入样本进行反应，洗涤后加入特异性检测抗体标记物反应，或同时加入样本和特异性检测抗体标记物反应， c)洗涤后加入增强液，检测分析。 9.根据权利要求8所述的检测试剂盒的使用方法，其特征在于，采用三明治夹心法中的一种：固相包被特异性捕获抗体，加入样本进行反应，洗涤，加入特异性检测抗体标记物反应，洗涤后加入增强液，检测分析；具体地，步骤如下： (1)固相包被：将特异性捕获抗体溶于包被缓冲液配制成含有3～7μg/mL捕获抗体的包被液，取100～200μL包被液体积进行固相载体包被； (2)加样：取测试样50～150μL分别加入各固相载体(已包被有特异性捕获抗体)反应位中； (3)孵育：将装有测试样的固相载体在振荡仪上进行孵育30～120分钟，振荡频率为750～1150rpm，孵育温度为20～30℃； (4)洗板：弃去测试样，并用清洗液工作液(清洗液稀释26倍)分别洗涤各反应位1～6次； (5)抗体孵育：向各反应位中分别加入50～150μL的抗体标记物工作液(特异性检测抗体标记物与实验缓冲液按1：1200配制而成，现配现用)，并在振荡仪上孵育30～120分钟，振荡频率为750～1150rpm，孵育温度为20～30℃； (6)洗板：弃去标记物工作液，并用清洗液洗涤各反应物2～10次； (7)信号增强：分别向每个反应位中加入50～150μL增强液，并振荡反应1～30分钟； (8)荧光信号检测及分析：使用时间分辨免疫荧光测定仪进行检测，并根据检测数据进行结果分析。 10.根据权利要求9所述的检测试剂盒进行胎盘生长因子检测的方法，其特征在于，步骤(1)中所述包被液体积为150μL，所述包被液中所述捕获抗体浓度为5μg/mL，所述包被缓冲液为20mmol/L，pH4.5的磷酸盐缓冲液；步骤(2)中测试样的加入量为100μL；步骤(3)、(5)孵育过程中的孵育温度为30℃，孵育时间为60min，振荡频率1150rpm；步骤(4)中洗板次数为2次；步骤(6)中的洗板次数为6次；步骤(7)中增强液的加入量为100μL，反应时间为5分钟。
所属类别：	发明专利