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原文传递检测人血清DLK1蛋白的ELISA试剂盒及其用途

专利名称：	检测人血清DLK1蛋白的ELISA试剂盒及其用途
摘要：	本发明公开了一种检测人血清DLK1蛋白的ELISA试剂盒及其用途。本发明的ELISA试剂盒的抗原采用重组的人DLK1抗原。本发明的检测方法具有高敏感性和特异性，并能快速检验出DLK1的表达和肝癌和肝母细胞瘤，本发明的ELISA试剂盒在肝癌和肝母细胞瘤的防治和诊断中拥有广阔的应用前景。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	上海;31
申请人：	上海交通大学
发明人：	韩泽广;徐晓;翟杨杨
专利状态：	有效
申请日期：	2018-01-11T00:00:00+0800
发布日期：	2019-07-19T00:00:00+0800
申请号：	CN201810027820.8
公开号：	CN110031629A
代理机构：	上海汉声知识产权代理有限公司
代理人：	庄文莉
分类号：	G01N33/68(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	200240 上海市闵行区东川路800号
主权项：	1.一种分泌DLK1单克隆抗体的杂交瘤细胞系，其特征在于，所述杂交瘤细胞系为SP2/0和Balb/c小鼠脾细胞单克隆抗体杂交瘤细胞株；保藏编号分别为CGMCC No.11596或CGMCCNo.11595。 2.一种DLK1单克隆抗体，其特征在于，所述DLK1单克隆抗体由如权利要求1所述的杂交瘤细胞系分泌产生。 3.一种如权利要求2所述的DLK1单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤： S1、制备重组人DLK1蛋白为免疫原； S2、动物免疫：通过反复多次小剂量的小鼠皮下免疫，获得分泌高效价的抗人DLK1单克隆抗体的小鼠； S3、挑取分泌高效价的抗人DLK1单克隆抗体的小鼠，取其脾脏细胞，在体外与小鼠骨髓瘤细胞融合； S4、酶联免疫吸附试验筛选抗体分泌阳性的杂交瘤细胞； S5、阳性杂交瘤细胞经亚克隆鉴定得到稳定分泌抗人DLK1单克隆抗体的杂交瘤单克隆细胞； S6、将杂交瘤单克隆细胞扩增培养，收集培养液，采用亲合层析法分离纯化抗人DLK1单克隆抗体。 4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤S1具体为：插入片段kappa sp-DLK1soluble reg-His6tag,将其克隆到哺乳动物表达载体pCPC载体中，获得表达质粒pCPC-DLK1-His，转染293-E/CHOE细胞，筛选出高效表达工程细胞株，细胞株经培养扩增、收集上清分离纯化后，获得纯度95％以上的重组人DLK1蛋白。 5.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤S2中，小鼠皮下免疫的方法为：将纯化的所述重组人DLK1蛋白与弗氏完全佐剂混合，于皮下多点注射小鼠。 6.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤S6中，所述亲合层析法具体为：将含单克隆抗体的杂交瘤单克隆细胞滤液上清上样于预先填充有共价交联了重组人DLK1蛋白的Ni-EF亲合层析柱中；上样完毕，亲合层析柱以0.1M Tris-HCL Ph8.0洗脱去除杂蛋白,再以柠檬酸洗脱被Ni-EF柱吸附的抗体蛋白，再透析；透析后的样品再经过滤后即获得纯化的抗人DLK1单克隆抗体。 7.一种检测人血清DLK1蛋白的ELISA试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：已包被权利要求2所述的DLK1单克隆抗体的固相载体、酶标记的权利要求2所述的DLK1单克隆抗体、酶的底物、阴性对照品和阳性对照品、包被液、洗涤液以及酶反应终止液。 8.根据权利要求7所述的检测人血清DLK1蛋白的ELISA试剂盒，其特征在于，所述的酶标记的DLK1单克隆抗体分为两种，包括： 1号酶结合物，采用生物素标记的由保藏编号为CGMCC No.11596的杂交瘤细胞系分泌产生的小鼠抗人DLK1单克隆抗体； 2号酶结合物，采用辣根过氧化物酶链亲和素标记的由保藏编号为CGMCC No.11595的杂交瘤细胞系分泌产生的小鼠抗人DLK1单克隆抗体。 9.一种采用权利要求7或8所述的ELISA试剂盒进行人血清DLK1蛋白的检测方法，其特征在于，所述方法包含如下步骤： A1、样本稀释：用样本稀释液将待检血清稀释； A2、加样反应： A2-1、样本检测孔每孔分别加已稀释样本血清，每个样本平行检测做两个或两个以上的重复孔，同时设同样数量的阴性、阳性及空白对照，取阴性、阳性对照品分别加入反应孔内，空白对照孔加入样本稀释液； A2-2、37℃避光反应60分钟后甩去孔内液体，每孔用样本稀释液或洗涤液注满，立即甩去，再注满样本稀释液或洗涤液，静置2分钟，甩去液体，重复洗涤3次，每次均需静置2分钟，最后一次甩去拍干； A3、加酶反应： A3-1、每孔加1号酶结合物的工作溶液，37℃避光反应60分钟后甩去孔内液体，如上洗涤，拍干； A3-2、每孔加2号酶结合物的工作溶液，37℃避光反应30分钟后甩去孔内液体，如上重复5次洗涤，拍干； A4、显色反应：每孔加配好的底物显色液TMB，室温反应10-15分钟，加酶反应终止液，混匀，终止反应，立即用酶标仪测读； A5、酶标仪测读数：将已终止反应的酶标板立即测读，以空白对照调零于450nm读取OD值；待检孔OD值大于或等于阴性对照2.0倍者为阳性。 10.一种如权利要求7或8所述的ELISA试剂盒在制备检测肝癌和肝母细胞瘤产品中的用途。
所属类别：	发明专利