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原文传递猪肺炎支原体固相竞争ELISA试剂盒及其制备方法和应用

专利名称：	猪肺炎支原体固相竞争ELISA试剂盒及其制备方法和应用
摘要：	发明公开了猪肺炎支原体固相竞争ELISA试剂盒及其制备方法和应用，包括猪肺炎支原体抗原蛋白包被的酶标板、参照样品、兔抗猪肺炎支原体阳性血清、兔抗猪肺炎支原体阴性血清。本发明试剂盒可对猪肺炎支原体抗原进行相对含量/效力测定，特异性好、重复性好，而且，所提供的固相竞争ELISA试剂盒操作简单，耗时短，不需要高端仪器设备，易于推广，适于疫苗生产检验及实验室研究应用。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	江苏;32
申请人：	江苏南农高科技股份有限公司
发明人：	车巧林;肖澄;缪芬芳;董彦鹏;徐凤;耿晓眉;胡静雅;靳蒙蒙;余姣
专利状态：	有效
申请日期：	2019-05-06T00:00:00+0800
发布日期：	2019-07-23T00:00:00+0800
申请号：	CN201910370182.4
公开号：	CN110045117A
代理机构：	北京卓岚智财知识产权代理事务所(特殊普通合伙)
代理人：	任漱晨
分类号：	G01N33/569(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	214405 江苏省无锡市江阴市锡澄路890号
主权项：	1.猪肺炎支原体固相竞争ELISA试剂盒，其特征在于，包括猪肺炎支原体抗原蛋白包被的酶标板、参照样品、兔抗猪肺炎支原体阳性血清、兔抗猪肺炎支原体阴性血清。 2.根据权利要求1所述的猪肺炎支原体固相竞争ELISA试剂盒，其特征在于，还包括10×浓缩洗涤液、样品稀释液/酶标抗体稀释液、TMB显色液和终止液。 3.根据权利要求2所述的猪肺炎支原体固相竞争ELISA试剂盒，其特征在于，所述的样品稀释液/酶标抗体稀释液，包括：W/W为0.8％的NaCl、W/W为0.02％的KCl、W/W为0.29％的Na2HPO4·12H2O、W/W为0.02％的KH2PO4、V/V为0.03～0.05％的Procline 300的水溶液；pH7.2；所述的10×洗涤液为10×PBST，含有V/V为0.05％的吐温20的PBS，pH7.2；所述的终止液是1.5mol/L的H2SO4。 4.根据权利要求1所述的猪肺炎支原体固相竞争ELISA试剂盒的制备方法，其特征在于，所述酶标板按照以下方法制备： (1)猪肺炎支原体抗原蛋白的制备培养好的猪肺炎支原体菌液高速离心获得菌体，PBS洗涤2遍以上后超声波破碎或高压均质破碎或SDS抽提制备抗原蛋白，抗原蛋白10～100倍浓缩后低温冷冻保存； (2)猪肺炎支原体抗原蛋白的包被用0.1mol/LpH9.6的碳酸盐缓冲液稀释猪肺炎支原体抗原蛋白至最佳包被浓度，包被96孔酶标板，每孔100μl，2～8℃过夜； (3)酶标板的封闭方法取出反应板，恢复室温，加入1×洗涤液，每孔300μl，洗涤3～5次；甩干洗涤液，在吸水纸上拍干孔内液体并驱除孔内气泡；加入封闭液，每孔200μl，2～8℃过夜封闭，1×洗涤液洗涤3～5次；甩干洗涤液，在吸水纸上拍干孔内液体并置通风厨中吹干酶标板，装入铝箔袋，放入干燥剂，抽真空后封口，2～8℃保存备用。 5.根据权利要求4所述的猪肺炎支原体固相竞争ELISA试剂盒的制备方法，其特征在于，所述的封闭液为含有W/W为5％的脱脂奶粉、W/W为0.8％的蔗糖、W/W为2％的海藻糖、V/V为0.03～0.05％的Procline300的PBS，pH7.2。 6.根据权利要求4所述的猪肺炎支原体固相竞争ELISA试剂盒的制备方法，其特征在于，所述的参照样品若为菌液抗原时，其制备方法同酶标板包被抗原的制备方法，抗原浓度为200μg/ml；参照样品若为疫苗类产品时，其制备方法为：将参考样品置于-70℃以下冷冻至少24小时；取出参照样品置37℃温浴20分钟；冰浴上超声3分钟，将超声处理过的样品置于超速离心管中，30000rpm4℃离心6小时；离心后切勿晃动，小心去除油层和上清液，用Kimwipe无尘纸去除离心管内壁上残留的油渍，将离心沉淀物溶解于1.0ml PBS中，封口膜封口，2～8℃过夜；次日，以最低输出功率在冰浴上超声5秒，使蛋白分散。 7.根据权利要求4所述的猪肺炎支原体固相竞争ELISA试剂盒的制备方法，其特征在于，所述的兔抗猪肺炎支原体阳性血清，按照以下方法制备： (1)兔抗猪肺炎支原体高免血清的制备猪肺炎支原体菌液经甲醛、核酸灭活剂等灭活剂灭活后，与佐剂乳化，健康兔先微量间接血凝试验检测，猪肺炎支原体抗体阴性的健康兔进行皮下多点免疫注射；首免后28日，皮下多点注射经佐剂乳化的猪肺炎支原体灭活菌液；二次免疫后14日，心脏少量采血，分离血清，用双向琼脂扩散试验测定血清效价，免疫次数不局限于两次，根据免疫后试血血清效价决定，若血清效价达到1:64以上，心脏大量采血，分离血清，制得猪肺炎支原体兔抗高免血清； (2)兔抗猪肺炎支原体阳性血清的纯化 MAB SELECT填料亲和层析柱用pH7.2的PBS平衡10个柱体积，然后加入离心弃沉淀的兔抗猪肺炎支原体高免血清，用10个柱体积的PBS洗涤杂蛋白，最后用5个柱体积的0.1MpH2.9的甘氨酸-HCl洗脱，收集洗脱液，即制得纯化的兔抗猪肺炎支原体阳性血清，纯化的阳性血清进行SDS-PAGE纯度鉴定和免疫印迹特异性鉴定； (3)兔抗猪肺炎支原体阳性血清的制备根据间接ELISA阳性血清最佳稀释度确定结果，将纯化的高免血清进行1:25000稀释，加5％蔗糖，分装，2～8℃保存。 8.根据权利要求7所述的猪肺炎支原体固相竞争ELISA试剂盒的制备方法，其特征在于，所述的兔抗猪肺炎支原体高免血清制备时，使用的佐剂包括弗氏佐剂、水佐剂、水包油佐剂、油包水佐剂。 9.根据权利要求1所述的猪肺炎支原体固相竞争ELISA试剂盒的应用，其特征在于，用于猪肺炎支原体抗原相对含量的测定；或者用于疫苗产品抗原相对效力测定，替代动物试验进行效力检验，评价疫苗是否合格。 10.根据权利要求1到3所述的猪肺炎支原体固相竞争ELISA试剂盒的使用方法，其特征在于，按照以下方法进行： (1)10×浓缩洗涤液用去离子水稀释成1×工作洗涤液； (2)参照样品、待检样品在稀释板上进行2倍倍比稀释，然后转移50μl液体至猪肺炎支原体抗原蛋白包被好的96孔酶标板的相应孔； (3)向上述96孔酶标板剩余列中分别加入兔抗猪肺炎支原体阴性血清一列，兔抗猪肺炎支原体阳性血清一列，PBS一列，每孔100μl； (4)待检样品和参照样品列中每孔加入50μl兔抗猪肺炎支原体阳性血清，盖好酶标板； (5)酶标板置37℃反应1.5小时； (6)倒掉孔内液体，用1×洗涤液洗涤3～5次，每孔300μ1，最后一次洗涤后拍干板子； (7)每孔加入100μ1用酶标抗体稀释液以1:2000稀释的过氧化物酶标记的羊抗兔IgG，酶标板置37℃反应1小时； (8)倒掉孔内液体，用1×洗涤液洗涤3～5次，每孔300μ1，最后一次洗涤后拍干板子； (9)每孔加入100μ1TMB底物显色液，室温显色15分钟； (10)每孔加入100μ1终止液，10分钟内在酶标仪上读取OD450nm值； (11)结果计算：各孔OD450nm读数均应减去空白对照OD450nm读数；待检样品测定的OD450nm值采用RelPot4.0软件或参照现行《中华人民共和国药典》二部附录ⅩⅣ生物检定统计法(三、量反应平行线测定法)进行相对含量/效力RP值计算。
所属类别：	发明专利