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乙型肝炎特异性血清标志物的筛选方法
| 专利名称： | 乙型肝炎特异性血清标志物的筛选方法 |
| 摘要： | 本发明属于医药生物技术领域，涉及患者体内异性血清标志物的筛选方法，具体涉及乙型肝炎特异性血清标志物的筛选方法。本发明的筛选方法，包括以下步骤：血清样本的收集和贮存、血清样本的处理方法、正相和反相色谱技术条件、质谱数据采集和分析、非靶向代谢组数据处理、有显著性差异的结果筛选、筛选结果的验证和应用。 |
| 专利类型： | 发明专利 |
| 国家地区组织代码： | 北京;11 |
| 申请人： | 中国医学科学院病原生物学研究所 |
| 发明人： | 张婷;杨帆 |
| 专利状态： | 有效 |
| 申请日期： | 2019-04-30T00:00:00+0800 |
| 发布日期： | 2019-07-26T00:00:00+0800 |
| 申请号： | CN201910357896.1 |
| 公开号： | CN110057955A |
| 代理机构： | 北京华科联合专利事务所(普通合伙) |
| 代理人： | 王为;孟旭 |
| 分类号： | G01N30/88(2006.01);G;G01;G01N;G01N30 |
| 申请人地址： | 100176 北京市大兴区经济技术开发区荣京东街6# |
| 主权项： | 1.乙型肝炎特异性的血清代谢标志物的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤： 血清样本的收集和贮存、血清样本的处理方法、正相和反相色谱技术条件、质谱数据采集和分析、非靶向代谢组数据处理、有显著性差异的结果筛选、筛选结果的验证和应用。 2.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤： (1)血清或血浆样本的收集和贮放方法： 选取HBV核酸检测呈阳性或HBV酶免三项呈阳性或两阳性的患者，取患者的血清或血浆两小时之内保存到-80℃，作为HBV实验组，同时找出同年龄段的正常人，取其血清或血浆作为对照组， (2)血清样本的处理方法： 血清样本处理方法有两种，a、反相色谱分析血清样本处理方法，采用C18反相色谱柱，b、亲水色谱分析血清样本处理方法，采用Hillic色谱柱， (3)正相和反相色谱技术条件： 色谱分离采用Thermo Scientific的U3000快速液相色谱使用C18反相色谱和HIL LIC亲水色谱对血清样本进行分析， (4)质谱数据采集和分析： 将上述的色谱柱与质谱相联，质谱分析采用装备了热电喷雾离子源的四极杆轨道离子阱质谱仪， (5)非靶向代谢组数据处理： 所有采集好的数据，无论是何种分离模式或是正负离子模式，均采用Progenesis QI软件处理，包括的步骤依次为导入原始数据、峰对齐、峰提取、归一化处理，最终形成保留时间、质荷比和峰强度的表格，代谢物鉴定采用人类代谢组数据库和脂质数据库进行一级分子量匹配， (6)有显著性差异的结果筛选： 利用EZinfo 3.0软件分析上述质谱数据进行筛选，首先对数据进行均一化处理，用PCA进行非监督性的模型分析结合用OPLS-DA的监督性模型分析，根据VIP值大于1结合p值小于0.05，筛选HBV实验组和对照组中代谢差异物， (7)筛选结果的验证和应用： 对上述的代谢差异物通过二级质谱和HMDB对代谢差异物进行鉴定，并根据定量结果利用ROC曲线分析，在95％可信区间，计算敏感性、特异性和可信区间，AUC在0.81-0.97之间。 3.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，血清样本处理方法有两种， a、反相色谱分析血清样本处理方法：用体积比3:1的氯仿和甲醇混合物提取脂溶性物质用于反相色谱分析，色谱柱为C18反相色谱柱， b、亲水色谱分析血清样本处理方法：用乙腈提取水溶性物质用于亲水色谱的分析，色谱柱为Hillic色谱柱。 4.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，质谱数据采集和分析：将上述的色谱柱与质谱相联，质谱分析采用装备了热电喷雾离子源的四极杆轨道离子阱质谱仪，正负离子离子源电压分别为3.7kv和3.5kV，毛细管加热温度320℃。翘气压力30psi，辅助气压力10psi。容积加热蒸发温度300℃，翘气和辅助气均为氮气，碰撞气为氮气，压力为1.5mTorr，一级全扫描参数为：分辨率70000，自动增益控制目标为1×106，最大隔离时间50ms，质荷比扫描范围50–1500，液质系统由Xcalibur 2.2 SP1.48软件控制，数据采集和靶向代谢物定量处理均由该软件操作。 5.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，筛选并鉴定与乙型肝炎病毒相关的特异性血清代谢标志物为： Creatinine、L-Proline、L-Arginine、PC(P-16:0/20:4(8Z,11Z,14Z,17Z))、PE(18:2(9Z,12Z)/18:1(9Z))、PC(o-16:1(9Z)/18:2(9Z,12Z))、PC(P-16:0/18:1(11Z))、PE(18:2(9Z,12Z)/18:0)、PE(P-16:0/22:4(7Z,10Z,13Z,16Z))、PE(P-16:0/22:4(7Z,10Z,13Z,16Z))、PE(P-18:0/18:2(9Z,12Z))、PE(18:0/18:1(11Z))、LysoPE(18:0/0:0)、PE(16:0/18:1(11Z))、或PE(18:2(9Z,12Z)/16:0)中的一种或多种。 6.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤： (1)血清样本的收集和贮存： 选取30例乙型肝炎病人，诊断标准HBV核酸检测呈阳性或HBV酶免两项或三项呈阳性，排除肝癌和其它感染或疾病的任一种，取清晨空腹血清，1小时之内-80℃保存，作为HBV实验组， 选取同样年龄的30例正常人的血清，1小时之内-80℃保存，作为对照组， (2)反相色谱分析血清样本处理方法 1)贮存于负80℃的血浆/血清样本在4℃的冰融化30-60分钟， 2)取100ul血清至标记好标签的1.5ml离心管中，加入600ul，体积比为3:1氯仿：甲醇的混合溶液，超声1h，加入100ul水，混匀， 3)12000rpm，4摄氏度，离心10分钟，取下层氯仿300ul浓缩干燥，加入400ul，体积比为1:1的异丙醇：乙腈进行复溶，超声溶解，12000rpm离心10min，取上层溶液100ul，置于200ul内衬管中，待测， (3)亲水色谱分析血清样本处理方法： 1)血浆/血清样本在4℃的冰融化，30-60分钟， 2)取100ul血清至标记好标签的1.5ml离心管中，加入300μl的乙腈， 3)充分振荡15秒，进行蛋白沉淀，12000rpm，4摄氏度，离心10分钟，取上层溶液100ul，置于200ul内衬管中，待测， (4)正相和反相色谱技术条件： 色谱分离采用Thermo Scientific的U3000快速液相色谱使用反相色谱和亲水色谱对上述血清处理后的样本进行分析， C18反相色谱柱流动相:A(乙腈/水4:6,0.1％甲酸,10mM乙酸铵)和B(乙腈/异丙醇9:1,0.1％甲酸,10mM乙酸铵)；流速：0.3ml/min；进样量为1.0μL；柱温：50℃，Hillic亲水色谱柱流动相:A(乙腈,0.1％甲酸,10mM乙酸铵)和B(水,0.1％甲酸,10mM乙酸铵)；流速：0.3ml/min；进样量为1μL；柱温：40℃， (5)质谱数据采集和分析： 将上述的色谱柱与质谱相联，采用装备了热电喷雾离子源的四极杆轨道离子阱质谱仪，正负离子离子源电压分别为3.7kv和3.5kV，毛细管加热温度320℃，翘气压力30psi，辅助气压力10psi，容积加热蒸发温度300℃，翘气和辅助气均为氮气，碰撞气为氮气，压力为1.5mTorr，一级全扫描参数为：分辨率70000，自动增益控制目标为1×106，最大隔离时间50ms，质荷比扫描范围50–1500，液质系统由Xcalibur 2.2 SP1.48软件控制，数据采集和靶向代谢物定量处理均由该软件操作， (6)非靶向代谢组数据处理： 所有采集好的数据，无论是何种分离模式或是正负离子模式，均采用Progenesis QI软件处理，包括的步骤依次为导入原始数据、峰对齐、峰提取、归一化处理，最终形成保留时间、质荷比和峰强度的表格，反相色谱和亲水色谱提取峰的时间依次为1至19和1至12分钟，峰提取的强度限定为模式3，各种添加剂离子如加氢和加钠等均去卷积到每一个离子特征，代谢物鉴定采用人类代谢组数据库和脂质数据库进行一级分子量匹配， (7)有显著性差异的结果筛选： 利用EZinfo 3.0软件分析上述质谱数据进行筛选，首先对数据进行均一化处理，用PCA进行非监督性的模型分析结合用OPLS-DA的监督性模型分析，根据VIP值大于1结合p值小于0.05，筛选HBV组和对照组代谢差异物， (8)筛选结果的验证和应用： 对上述的代谢差异物通过二级质谱和HMDB对代谢差异物进行鉴定，并根据定量结果利用ROC曲线分析，在95％可信区间，计算敏感性、特异性和可信区间，AUC在0.81-0.97之间。 7.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤： (1)血清样本的收集和贮存： 选取30例乙型肝炎病人，诊断标准HBV核酸检测呈阳性或HBV酶免两项或三项呈阳性，排除肝癌和其它感染或疾病的任一种，取清晨空腹血清，1小时之内-80℃保存，作为HBV实验组， 选取同样年龄的30例正常人的血清，1小时之内-80℃保存，作为对照组， (2)反相色谱分析血清样本处理方法 1)贮存于负80℃的血浆/血清样本在4℃的冰融化30-60分钟， 2)取100ul血清至标记好标签的1.5ml离心管中，加入600ul，体积比为3:1氯仿：甲醇的混合溶液，超声1h，加入100ul水，混匀， 3)12000rpm，4摄氏度，离心10分钟，取下层氯仿300ul浓缩干燥，加入400ul异丙醇：乙腈1:1复溶，超声溶解，12000rpm离心10min，取上层溶液100ul，置于200ul内衬管中，待测， (3)亲水色谱分析血清样本处理方法： 1)血浆/血清样本在4℃的冰融化为30-60分钟， 2)取100ul血清至标记好标签的1.5ml离心管中，加入300μl的乙腈， 3)充分振荡15秒，进行蛋白沉淀，12000rpm，4摄氏度，离心10分钟，取上层溶液100ul，置于200ul内衬管中，待测， (4)正相和反相色谱技术条件： 色谱分离采用Thermo Scientific的U3000快速液相色谱使用反相色谱和亲水色谱对上述血清处理后的样本进行分析， 1)C18反相色谱柱:waters UPLC HSS T3，型号1.8um2.1mm*100mm； 2)C18反相色谱柱流动相:A(乙腈/水4:6,0.1％甲酸,10mM乙酸铵)和B(乙腈/异丙醇9:1,0.1％甲酸,10mM乙酸铵)；流速：0.3ml/min；进样量为1.0μL；柱温：50℃，C18反相色谱测定脂质洗脱程序如下： 3)Hillic亲水色谱柱:waters UPLC BEH Amide(1.7um2.1mm*100mm)； 4)Hillic亲水色谱柱流动相:A(乙腈,0.1％甲酸,10mM乙酸铵)和B(水,0.1％甲酸,10mM乙酸铵)；流速：0.3ml/min；进样量为1μL；柱温：40℃，洗脱程序如下： (5)质谱数据采集和分析： 将上述的色谱柱与质谱相联，采用装备了热电喷雾离子源的四极杆轨道离子阱质谱仪，正负离子离子源电压分别为3.7kv和3.5kV，毛细管加热温度320℃，翘气压力30psi，辅助气压力10psi，容积加热蒸发温度300℃，翘气和辅助气均为氮气，碰撞气为氮气，压力为1.5mTorr，一级全扫描参数为：分辨率70000，自动增益控制目标为1×106，最大隔离时间50ms，质荷比扫描范围50–1500，液质系统由Xcalibur 2.2 SP1.48软件控制，数据采集和靶向代谢物定量处理均由该软件操作， (6)非靶向代谢组数据处理： 所有采集好的数据，无论是何种分离模式或是正负离子模式，均采用Progenesis QI软件处理，包括的步骤依次为导入原始数据、峰对齐、峰提取、归一化处理，最终形成保留时间、质荷比和峰强度的表格，反相色谱和亲水色谱提取峰的时间依次为1至19和1至12分钟，峰提取的强度限定为模式3，各种添加剂离子如加氢和加钠等均去卷积到每一个离子特征，代谢物鉴定采用人类代谢组数据库和脂质数据库进行一级分子量匹配， (7)有显著性差异的结果筛选： 利用EZinfo3.0软件分析上述质谱数据进行筛选，首先对数据进行均一化处理，用PCA进行非监督性的模型分析结合用OPLS-DA的监督性模型分析，根据VIP值大于1结合p值小于0.05，筛选HBV组和对照组代谢差异物， (8)筛选结果的验证和应用： 对上述的代谢差异物通过二级质谱和HMDB对代谢差异物进行鉴定，并根据定量结果利用ROC曲线分析，在95％可信区间，计算敏感性、特异性和可信区间，AUC在0.81-0.97之间。 8.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤： (1)血清样本的收集和贮存： 选取30例乙型肝炎病人，诊断标准HBV核酸检测呈阳性或HBV酶免两项或三项呈阳性，排除肝癌和其它感染或疾病的任一种，取清晨空腹血清，1小时之内-80℃保存，作为HBV实验组， 选取同样年龄的30例正常人的血清，1小时之内-80℃保存，作为对照组， (2)反相色谱分析血清样本处理方法 1)贮存于负80℃的血浆/血清样本在4℃的冰融化30-60分钟， 2)取100ul血清至标记好标签的1.5ml离心管中，加入600ul，体积比为3:1氯仿：甲醇的混合溶液，超声1h，加入100ul水，混匀， 3)12000rpm，4摄氏度，离心10分钟，取下层氯仿300ul浓缩干燥，加入400ul异丙醇：乙腈1:1复溶，超声溶解，12000rpm离心10min，取上层溶液100ul，置于200ul内衬管中，待测， (3)亲水色谱分析血清样本处理方法： 1)血浆/血清样本在4℃的冰融化为30-60分钟， 2)取100ul血清至标记好标签的1.5ml离心管中，加入300μl的乙腈 3)充分振荡15秒，进行蛋白沉淀，12000rpm，4摄氏度，离心10分钟，取上层溶液100ul，置于200ul内衬管中，待测， (4)色谱分离采用Thermo Scientific的U3000快速液相色谱使用反相色谱和亲水色谱对上述血清处理后的样本进行分析， 1、C18反相色谱柱:waters UPLC HSS T3(1.8um2.1mm*100mm)； 2、C18反相色谱柱流动相:A(乙腈/水4:6,0.1％甲酸,10mM乙酸铵)和B(乙腈/异丙醇9:1,0.1％甲酸,10mM乙酸铵)；洗脱程序:见表1，流速：0.3ml/min；进样量为1.0μL；柱温：50℃， 表1 C18反相色谱测定脂质洗脱程序 3、Hillic亲水色谱柱:waters UPLC BEH Amide(1.7um2.1mm*100mm)； 4、Hillic亲水色谱柱流动相:A(乙腈,0.1％甲酸,10mM乙酸铵)和B(水,0.1％甲酸,10mM乙酸铵)；洗脱程序:见表2,流速：0.3ml/min；进样量为1μL；柱温：40℃， 表2 HILIC测定极性小分子洗脱程序: (5)质谱数据采集和分析：采用装备了热电喷雾离子源的四极杆轨道离子阱质谱仪，正负离子离子源电压分别为3.7kv和3.5kV，毛细管加热温度320℃，翘气压力30psi，辅助气压力10psi，容积加热蒸发温度300℃，翘气和辅助气均为氮气，碰撞气为氮气，压力为1.5mTorr，一级全扫描参数为：分辨率70000，自动增益控制目标为1×106，最大隔离时间50ms，质荷比扫描范围50–1500，液质系统由Xcalibur 2.2 SP1.48软件控制，数据采集和靶向代谢物定量处理均由该软件操作，所有采集好的数据，无论是何种分离模式或是正负离子模式，均采用Progenesis QI软件处理，包括的步骤依次为导入原始数据、峰对齐、峰提取、归一化处理，最终形成保留时间、质荷比和峰强度的表格，反相色谱和亲水色谱提取峰的时间依次为1至19和1至12分钟，峰提取的强度限定为模式3，各种添加剂离子如加氢和加钠等均去卷积到每一个离子特征，代谢物鉴定采用人类代谢组数据库和脂质数据库进行一级分子量匹配， 指控样本的前处理方法和其他样品一样，首先采用5个空白样本平衡色谱柱，再采用3个质控样本平衡柱条件，然后每间隔6-8个样本插入1个质控样本用于监测整个液质系统的稳定性和重复性，同时计算质控样本中提取的代谢特征的变异系数值，变异系数超过15％的代谢特征被删除， (6)质控评估 首先使用无监督技术PCA(主成分分析)对QC样本和其他实验样本进行分析，QC样品是相同的成分，他们应该在PCA得分图中聚在一起， (7)样本分析 1、PCA分析 对样本进行主成分分析能从总体上反映样本之间的代谢差异和组内样本之间的变异度的大小，在使用EZinfo3.0软件正式分析前，对数据组进行归一化处理， 2、OPLS-DA分析 采用监督性的多维统计方法即偏最小二乘方判别分析(OPLS-DA)对两组样本进行统计分析， 3、组间潜在生物标志物鉴定 本次实验采用对照组和HBV实验组的OPLS-DA模型的VIP值(阈值>1)，并结合t-test的p值(p＜0.05)来寻找差异性表达代谢物，并分别比较了这些差异代谢物在对照组和HBV实验组，HBV实验组中是否存在差异，差异性代谢物的定性方法为：搜索在线数据库，与对照组的倍数大于1找出了15个有意义的差异性化合物。 |
| 所属类别： | 发明专利 |
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