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原文传递一种基于金磁微粒的时间分辨荧光免疫检测方法

专利名称：	一种基于金磁微粒的时间分辨荧光免疫检测方法
摘要：	本发明涉及一种基于金磁微粒的时间分辨荧光免疫检测方法，属于免疫学检测领域。本发明提供基于金磁微粒的时间分辨荧光免疫检测方法，包括免疫金磁微粒液的制备，用镧系元素鳌合物标记抗原或抗体，获得荧光标记物，将待检测样品加入免疫金磁微粒液中，再荧光标记物，混匀孵育，然后洗涤金磁微粒，反应体系中加入荧光增强物，然后检测反应体系中标记物的荧光。本发明提供的基于金磁微粒的时间分辨荧光免疫检测方法，首次将金磁微粒包被生物原料技术用于时间分辨荧光检测，大大提高检测范围，缩短反应时间，提高灵敏度，金磁微粒可以和不同的探针分子结合，使检测同一样本中不同的待测物成为可能。
专利类型：	发明专利
申请人：	广州源起健康科技有限公司
发明人：	李根平;庄雨璋;李爱霞
专利状态：	有效
申请日期：	1900-01-20T00:00:00+0805
发布日期：	1900-01-20T17:00:00+0805
申请号：	CN201911422978.6
公开号：	CN111024940A
代理机构：	广州三环专利商标代理有限公司
代理人：	颜希文
分类号：	G01N33/543;G01N33/533;G01N21/64;G;G01;G01N;G01N33;G01N21;G01N33/543;G01N33/533;G01N21/64
申请人地址：	510655 广东省广州市广州高新技术产业开发区瑞泰路2号C栋二层自编C01号
主权项：	1.一种基于金磁微粒的时间分辨荧光免疫检测方法，其特征在于，包括如下步骤： (1)免疫金磁微粒液的制备，具体操作如下： (1.1)包被抗体或抗原的预处理：取抗体或抗原加入离心管中，离心，用结合缓冲液洗涤，浓缩； (1.2)金磁微粒与抗体或抗原的结合：取金磁微粒于离心管中，结合磁力架，用结合缓冲液洗涤，弃上清液，然后往离心管中再加入步骤(1.1)中预处理后的抗体或抗原，振荡混匀孵育； (1.3)封闭：将步骤(1.2)中孵育后的金磁微粒用封闭液洗涤，再加入封闭液，然后振荡混匀封闭； (1.4)将完成步骤(1.3)的金磁微粒用保存液洗涤，再加入保存液，然后低温下保存，即可制得免疫金磁微粒液； (2)用镧系元素鳌合物标记抗原或抗体，获得荧光标记物； (3)将待检测样品加入步骤(1)所述的免疫金磁微粒液中，再加入步骤(2)所述的荧光标记物，混匀孵育，然后洗涤金磁微粒； (4)往完成步骤(3)的反应体系中加入荧光增强物，然后检测反应体系中标记物的荧光，即可获得检测样品的信息。 2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(1.1)中，所述离心管为30KD的超滤离心管，所述离心的速度为10000r/min，所述离心的温度为4℃，所述离心的时间为9min～10min，所述结合缓冲液为0.05MpH8.0～9.0的Tris-HCl缓冲液，所述洗涤次数为3～5次。 3.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(1.2)中，所述结合缓冲液为0.05MpH8.0～9.0的Tris-HCl缓冲液，所述洗涤次数为3～5次，所述抗体或抗原与金磁微粒混合的质量比为1:50，所述孵育的温度为20℃～28℃。 4.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(1.3)中，所述用封闭液洗涤的次数为3～5次，再加入封闭液后的金磁微粒浓度为2mg/ml，所述封闭的温度为20℃～28℃，所述封闭的时间为30min，所述封闭液的为含有质量浓度5％BSA的Tris-HCl缓冲液，所述的Tris-HCl缓冲液的体积摩尔浓度为0.05M，所述的Tris-HCl缓冲液的pH为8.0～9.0。 5.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(1.4)中，所述保存液为含有体积百分浓度0.1％Tween-20的Tris-HCl缓冲液，所述Tris-HCl缓冲液的体积摩尔浓度为0.05M，所述的Tris-HCl缓冲液的pH为8.0～9.0，所述用保存液洗涤的次数为3～5次，再加入保存液后的金磁微粒浓度为10mg/ml，所述低温为2～8℃。 6.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)中，获得荧光标记物的具体操作如下： (2.1)标记抗体或抗原的预处理：取抗体或抗原加入离心管中，离心，用标记缓冲液洗涤，浓缩；抗体与铕螯合物质量比为1:3 (2.2)镧系元素鳌合物标记抗原或抗体：取溶解后的镧系元素鳌合物与步骤(2.1)中预处理后的抗体或抗原，以质量比3:1放入旋转培养器中，反应16-20h，获得镧系元素鳌合物标记物，然后纯化镧系元素鳌合物标记物，低温保存，即可获得荧光标记物。 7.如权利要求6所述的检测方法，其特征在于，步骤(2.1)中，所述离心管为30KD的超滤离心管，所述离心的速度为10000r/min，所述离心的温度为4℃，所述离心的时间为9min～10min，所述标记缓冲液为0.05M pH8.0～9.0的CBS缓冲液，所述洗涤次数为3～5次。 8.如权利要求6所述的检测方法，其特征在于，步骤(2.2)中，所述镧系元素鳌合物的镧系元素为铕或钐，所述镧系元素鳌合物的螯合剂为异硫氰酸苯基-EDTA、异硫氰酸苯甲基-DTTA、P-异硫氰基苄基-DTTA或二乙烯三胺五醋酸氨基苯基-EDTA，所述反应的温度为20℃～28℃，所述纯化为用SepHadex TM G-50葡聚糖凝胶柱纯化镧系元素鳌合物标记物，所述低温为2～8℃。 9.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(3)中，所述孵育时间5min，所述孵育温度37℃，所述洗涤次数为4次。 10.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(4)中，以质量浓度计，所述荧光增强物包括0.03％乙酸钠、0.0002～0.0009％β-NTA、0.0024％TOPO、0.08％醋酸、0.1％无水乙醇和0.05％Triton X-100水溶液，用时间分辨荧光仪检测反应体系中标记物的荧光。
所属类别：	发明专利