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原文传递 CD47抗体在肝癌放疗敏感性检测试剂盒中的应用

专利名称：	CD47抗体在肝癌放疗敏感性检测试剂盒中的应用
摘要：	本发明提供CD47抗体在肝癌放疗敏感性检测试剂盒中的应用。本发明的优势在于(a)提供了预测用于肝放疗治疗效果的标志物，有助于患者治疗方案的选择。(b)提前分析患者对放疗的敏感性，避免无效治疗。(c)外周血CD47的检测方法更方便快速，更容易为病人接受。
专利类型：	发明专利
申请人：	上海东方肝胆外科医院
发明人：	程树群;卫旭彪;蒋亚波
专利状态：	有效
申请日期：	1900-01-20T09:00:00+0805
发布日期：	1900-01-20T08:00:00+0805
申请号：	CN202010021665.6
公开号：	CN111122876A
代理机构：	上海精晟知识产权代理有限公司
代理人：	辇甲武
分类号：	G01N33/68;G01N33/574;G;G01;G01N;G01N33;G01N33/68;G01N33/574
申请人地址：	200082 上海市杨浦区长海路225号
主权项：	1.CD47抗体在肝癌放疗敏感性检测试剂盒中的应用。 2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：步骤一，制作组织切片，步骤二，组织切片中CD47表达水平的检测, 步骤三，评分和判断。 3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：步骤一中，采用石蜡包埋法制作组织切片，包括步骤: (i)取样30min内放入固定液中，固定液的用量为组织块的20倍左右，固定时间为24h，固定液包括10％福尔马林、4％多聚甲醛或10％磷酸缓冲福尔马林； (ii)固定后的样本经流水冲洗(4～6h)后，用不同浓度的乙醇进行脱水处理，乙醇浓度为：30％→50％→70％→80％→90％→95％→100％(I)→100％(II)，每种浓度的乙醇体积为组织块50倍左右，时间总长约2～3h； (iii)将组织块放于二甲苯与无水乙醇比例为1:1的透明剂中1h，再置于二甲苯中透明20min； (iv)将透明后的组织块放入溶解状态的普通石蜡中1h，让材料里含有石蜡，浸蜡后的组织块放在装有蜡液的容器中，待蜡液表层凝固即迅速放入冷水中冷却，制成含有组织块的蜡块； (v)包埋好的蜡块用刀片修成规整的四棱台，以少许热蜡液将其底部迅速贴附于小木块上，用轮转式切片机进行切片，切片厚度为4～7μm，切出一片接一片的蜡带，用毛笔轻托轻放在纸上，再用粘附剂将展平的蜡片牢附于载玻片上。 4.如权利要求2所述的应用，其特征在于：步骤一中，采用冷冻法制作组织切片，包括步骤： (i)组织块放于支承器上，滴上包埋剂，放于冷冻台上冷冻； (ii)冷冻好的组织块，夹紧于冰冻切片机的持承器上，修整并切片，切片厚度为5～10μm，将切好的切片平整的粘附于载玻片上。 5.如权利要求1所述的应用，其特征在于：步骤二中，组织切片中CD47表达水平的检测步骤如下： (1)脱蜡水化:脱蜡前将组织拿出放在65℃烘箱中1h，然后浸入二甲苯2次，每次10min，再依次放入100％无水乙醇，90％无水乙醇，80％无水乙醇，70％无水乙醇各5min，最后放在蒸馏水中5min； (2)抗原修复：水浴锅加热的柠檬酸钠缓冲液至95℃左右，放入石蜡切片修复15-30min； (3)室温冷却后，PBS冲洗3遍，再用3％H2O2，室温孵育30min，PBS洗3遍,每次5min (4)5％的山羊血清封闭，室温孵育30min， (5)在切片上滴加一抗工作液，4℃置于湿盒中孵育过夜， (6)PBS洗3遍，每次5min，擦干切片后，滴加二抗工作液，置于湿盒中，室温孵育2小时； (7)PBS洗3遍，每次5min，滴加DAB显色液，于显微镜下观察颜色变化，蒸馏水充分冲洗终止反应； (8)HE复染，脱水透明，中性树脂封片。 6.如权利要求5所述的应用，其特征在于：步骤三中，检测结果分为：表达阴性(-)，表达弱阳性(+)和表达强阳性(++)，表达强阳性即判断为不适宜采用放疗进行治疗。 7.如权利要求1所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：步骤一、板的制备：步骤二、测定步骤；步骤三、评分和判断。 8.如权利要求7所述的应用，其特征在于：步骤一包括如下步骤: (1)将捕获抗体在不含载体蛋白的PBS中稀释至工作浓度，立即用每孔100μL稀释的捕获抗体包被96孔微孔板，密封板并在室温下孵育过夜， (2)吸出每个孔并用清洗缓冲液进行清洗，重复该过程两次，共3次清洗，最后一次清洗后，通过吸取或翻转印版并将其沾到干净的纸巾上，以除去所有剩余的清洗液， (3)向每个孔中添加300μL试剂稀释剂来封闭板，在室温下孵育至少1小时， (4)重复步骤2中的抽吸/冲洗步骤。 9.如权利要求7所述的应用，其特征在于：步骤二包括如下步骤: (1)每孔添加100μL样品或标准液，覆盖孔并在室温下孵育2小时， (2)重复抽吸/冲洗， (3)向每个孔中加入100μL检测抗体，覆盖孔并在室温下孵育2小时， (4)重复抽吸/冲洗， (5)向每个孔中添加100μL链霉亲和素-HRP的工作稀释液，覆盖孔并在室温下孵育20分钟， (6)重复抽吸/冲洗操作， (7)向每个孔中添加100μL底物溶液，在室温下孵育20分钟， (8)向每个孔中添加50μL终止溶液， (9)使用设置为450nm的酶标仪测定每个孔的吸光度。 10.如权利要求7所述的应用，其特征在于：步骤三中，根据染色强度：0＝不染色，1＝弱染色，2＝中度染色和3＝强染色，和染色细胞的百分比：0＝0％，1＝1–24％，2＝25–49％，3＝50–74％和4＝75–100％，将强度得分乘以染色细胞百分比的得分确定免疫反应得分，对9个等级的得分分别为0、1、2、3、4、6、8、9和12，4分及以下是低表达，5分及以上是高表达，高表达则提示不适宜进行放疗。
所属类别：	发明专利