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原文传递母猪初乳中PEDV特异性SIgA抗体的ELISA检测方法及其试剂盒

专利名称：	母猪初乳中PEDV特异性SIgA抗体的ELISA检测方法及其试剂盒
摘要：	本发明公开了一种母猪初乳中PEDV特异性SIgA抗体的ELISA检测方法，该法运用基因克隆、原核表达、多克隆抗体制备等技术，先从母猪初乳中克隆得到SIgA特有的成分SC片段，并构建原核表达载体对该片段进行表达，然后用PEDV病毒对制备的兔抗猪SC多克隆抗体进行包被，封闭后依次加入一抗、二抗和三抗各孵育1h，最后加终止液测OD450nm值。据此，发明人还研制了相应试剂盒。本发明具有经济、便捷、快速、准确的特点，为进一步探索母猪乳汁中PEDV特异性SIgA抗体的动态变化规律、PEDV粘膜免疫效果的评估以及免疫程序的优化提供了可靠的方法，也为预防PEDV对哺乳仔猪的感染提供科学依据。
专利类型：	发明专利
申请人：	广西大学
发明人：	欧阳康;王若木;杜琛;陆颖;黄伟坚;韦祖樟;陈樱
专利状态：	有效
申请日期：	1900-01-20T00:00:00+0805
发布日期：	1900-01-20T19:00:00+0805
申请号：	CN201911413128.X
公开号：	CN111175501A
代理机构：	广西南宁公平知识产权代理有限公司
代理人：	杨立华
分类号：	G01N33/569;G;G01;G01N;G01N33;G01N33/569
申请人地址：	530004 广西壮族自治区南宁市西乡塘区大学东路100号
主权项：	1.一种母猪初乳中PEDV特异性SIgA抗体的ELISA检测试剂盒，包括包被酶标板，其特征在于：所述包被酶标板以PEDV病毒粒子作为包被抗原。 2.根据权利要求1所述的ELISA检测试剂盒，其特征在于包括包被液、封闭液、SC兔多抗、HRP标记山羊抗兔IgG、洗涤液、稀释液、底物液、终止液。 3.根据权利要求1所述的ELISA检测试剂盒，其特征在于：所述PEDV病毒粒子由PEDV病毒液放置在紫外灯下灭活一个小时制备。 4.根据权利要求1所述的ELISA检测试剂盒，其特征在于所述SC兔多抗按以下方法制备： <1>猪SC片段基因的扩增及蛋白表达载体的构建从母猪初乳中对猪SC基因的110-374位氨基酸序列进行扩增，得到PCR产物；将PCR产物进行胶回收并克隆至pMD-18T载体上，与原核表达载体pET-32a进行双酶切，并对酶切产物进行回收和纯化后，通过T4连接酶在16℃的条件下进行酶切产物的连接，得到重组表达载体pET-32a-SC，并对其进行测序及双酶切鉴定； <2>重组质粒的诱导表达及检测将双酶切和测序结果均正确的重组质粒转化至BL21(DE3)pLysS ChemicallyCompetent Cell中并涂板培养，然后放置于37℃水平摇床进行扩增，待扩增的菌液OD值为0.6时，按照加入IPTG继续在37℃水平摇床诱导5h；将诱导好的菌液经离心，超声破碎等处理后进行SDS-PAGE电泳，以检测重组SC蛋白的表达情况和反应原性。 5.根据权利要求1所述的ELISA检测试剂盒，其特征在于步骤<1>中所述扩增为先进行RT-PCR扩增，然后进行PCR扩增；所述RT-PCR扩增体系共12.5μL，其中：TaKaRa：5×Buffer 2.5μL，TaKaRa：dNTP mix2.5mmol/μL，1μL，TaKaRa：M-MLV Reverse Transcriptase 200U/μL，0.25μL，Vazyme：RNasin酶抑制剂40U/μL，0.25μL，下游引物或Oligo dT 0.5μL，RNA 8μL，42℃作用1h，得到cDNA；所述PCR扩增反应体系共25μL，其中：ddH2O 8.5μL，上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，PRIMER STAR酶12.5μL，cDNA 3μL；扩增条件为：94℃预变性5min；进入循环：94℃变性40s、62℃退火40s，72℃延伸50s，34个循环；72℃再延伸10min后，4℃保存，得到目的片段；其中，所用SC片段引物为SC-F和SC-R，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1和SEQ.ID.No.2的碱基序列。 6.根据权利要求1所述的ELISA检测试剂盒，其特征在于步骤<1>中所述双酶切体系共100μL，其中：质粒33μL，内切酶EcoRⅠ7μL，内切酶HindⅢ7μL，10×Buffer 10μL，ddH2O 43μL，37℃水浴锅过夜双酶切。 7.根据权利要求1所述的ELISA检测试剂盒，其特征在于步骤<1>中所述酶切产物的连接体系共10μL，其中：T4 DNA连接酶1μL，双酶切重组质粒所回收的目的片段7μL，双酶切pET-32a载体所回收的目的片段1μL，T4 DNA连接酶Buffer 1μL；各组分混匀后，离心，16℃条件下连接至少8h。 8.一种母猪初乳中PEDV特异性SIgA抗体的ELISA检测方法，其特征在于包括以下步骤：抗原包被：将抗原PEDV病毒粒子和包被液加入酶标板，进行包被；封闭：加入含BSA的PBS作为封闭液进行封闭，弃去封闭液并用PBST洗去残余封闭液；加抗体：先加入初乳，37℃孵育1h，反应后用PBST洗涤；再加入SC兔多抗，37℃孵育1h，反应后用PBST洗涤；然后加入HRP标记山羊抗兔IgG，37℃孵育1h，反应后用PBST洗涤；显色和测定：加底物，避光显色后加入终止液，在酶标仪450nm波长下进行读数。 9.根据权利要求8所述的ELISA检测方法，其特征在于：所述包被抗原中，每孔包被的PEDV病毒粒子约为105，4℃的条件下至少包被12h；所述初乳按以下处理：收集母猪的初乳，在4～8℃的条件下3000rpm/min离心30分钟，弃掉上层脂肪和下层沉淀，取中间层乳清；所述封闭中，加入含体积百分比1％BSA的PBS作为封闭液，在37℃的条件下封闭2h；所述显色和测定中，加入TMB，在37℃的条件下避光反应20min后，加入终止液。 10.根据权利要求9所述的ELISA检测方法，其特征在于：所述初乳的稀释度为1：10，加入量为100μL；所述SC兔多抗的稀释度为1：1000，加入量为100μL；所述HRP标记山羊抗兔IgG的稀释度为1：2000，加入量为100μL。
所属类别：	发明专利