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原文传递猪流行性腹泻特异性SIgA抗体ELISA检测试剂盒及其应用

专利名称：	猪流行性腹泻特异性SIgA抗体ELISA检测试剂盒及其应用
摘要：	本发明公开猪流行性腹泻特异性SIgA抗体ELISA检测试剂盒及其应用，检测试剂盒包括重组蛋白S1D。本发明还公开基于S1D蛋白检测鼻液和唾液中猪流行性腹泻病毒SIgA的间接ELISA方法，通过基因克隆表达技术成功构建重组质粒，蛋白纯化亲和层析技术获取猪流行性腹泻病毒S1D蛋白，以S1D蛋白为包被抗原建立间接ELISA检测黏液中猪流行性腹泻病毒SIgA抗体方法。可用于猪群中猪流行性腹泻病毒特异性SIgA抗体检测，判断猪群中猪流行性腹泻病毒特异性SIgA抗体水平。该方法具有较好的特异性和敏感性，可应用于猪流行性腹泻病毒SIgA抗体的临床检测及黏膜免疫评价。本发明操作简单，应用范围广。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	江苏;32
申请人：	南京农业大学
发明人：	杨倩;王永恒;李昱辰
专利状态：	有效
申请日期：	2019-01-23T00:00:00+0800
发布日期：	2019-06-07T00:00:00+0800
申请号：	CN201910065715.8
公开号：	CN109856387A
代理机构：	南京苏高专利商标事务所(普通合伙)
代理人：	王艳
分类号：	G01N33/535(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	210095 江苏省南京市玄武区卫岗1号
主权项：	1.猪流行性腹泻特异性SIgA抗体ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括重组蛋白S1D。 2.根据权利要求1所述的ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述重组蛋白S1D是通过PCR方法从猪流行性腹泻病毒ZJ-08株全基因组扩增得到的S1D基因片段克隆到pET28a(+)中，然后转化至大肠杆菌BL21（DE3）细胞中，并表达纯化获得该重组蛋白。 3.根据权利要求2所述的ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述PCR方法中的引物序列如下： F:5’-AGTGCGGCCGCAAGCTTACTAAAGTTGGTGGGAATACTAATATTCCCAGTAACC-3’， R:5’-AAATGGGTCGCGGATCCGGGTTTAGTTCTTTCTGTGTTGACACTAGAC-3’。 4.根据权利要求1或2所述的ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述重组蛋白S1D的浓度为0.5~4μg/mL。 5.根据权利要求1或2所述的ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括辣根过氧化物酶标记羊抗猪IgA抗体、包被液、磷酸盐缓冲液、洗涤液、封闭液、稀释液、底物显色液和终止液。 6.根据权利要求3所述的ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述包被液的组成为：碳酸钠和碳酸氢钠加蒸馏水混合，调pH值到9.6。 7.根据权利要求3所述的ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液的组成为：氯化钠、磷酸二氢钾、氯化钾和十二水合磷酸氢二钠，加蒸馏水混合，调pH值到7.4。 8.根据权利要求3所述的ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述封闭液为PBS稀释的脱脂奶粉或PBS稀释的牛血清白蛋白。 9.一种基于S1D蛋白检测鼻液和唾液中猪流行性腹泻病毒SIgA的间接ELISA方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤： 1）包被抗原重组蛋白S1D的制备； 2）用碳酸盐缓冲液稀释包被抗原，包被96孔ELISA包被板， 4℃条件下包被12-14 小时后甩干，采用PBST洗涤3-4次，拍干；鼻拭子封闭采用PBS稀释的脱脂奶粉，口腔拭子封闭采用PBS稀释的牛血清白蛋白，37℃条件下封闭后甩干，用PBST洗涤3-4次，拍干；以PBS稀释的牛血清白蛋白作为样品稀释液进行稀释，37℃条件下孵育90 min后甩干，用PBST洗涤3-4次，拍干；HRP标记羊抗猪IgA抗体用样品稀释液稀释，37℃条件下孵育后甩干，用PBST洗涤3-4次，每次5 min，拍干；加入底物TMB显色液，37℃条件下作用7-15 min后加硫酸终止液终止反应；采用酶标仪OD450nm吸光度下读取数据； 3）利用以上ELISA方法检测PEDV阴性鼻拭子，口腔拭子样品，测定OD450nm值，计算阴性样品平均值和标准差SD，当待检样品OD450nm值≥+3SD，即可判定为阳性，其他判定为阴性。 10.根据权利要求9所述的间接ELISA方法，其特征在于，所述鼻拭子稀释比例为1：1，口腔拭子稀释比例为1：2。
所属类别：	发明专利