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原文传递一种血管内皮生长因子检测试剂盒及其制备方法

专利名称：	一种血管内皮生长因子检测试剂盒及其制备方法
摘要：	本发明涉及免疫检测领域，具体涉及一种血管内皮生长因子检测试剂盒，包被有VEGF抗体的磁性微球混悬液、VEGF参考品、VEGF质控品、VEGF标记物、浓缩洗涤液和发光底物液；其中VEGF标记物通过吖啶酯修饰物对改造的VEGF抗体进行标记。本发明的检测试剂盒具有检测结果准确、稳定性好、灵敏度高、线性范围宽的优点。
专利类型：	发明专利
申请人：	潍坊市康华生物技术有限公司
发明人：	田永帅;杨致亭;李建花;高永峰;兰文军
专利状态：	有效
申请日期：	1900-01-20T06:00:00+0805
发布日期：	1900-01-20T19:00:00+0805
申请号：	CN202010009910.1
公开号：	CN111175516A
代理机构：	潍坊正信致远知识产权代理有限公司
代理人：	李聚坤
分类号：	G01N33/68;G01N33/574;G01N33/543;G01N21/76;G;G01;G01N;G01N33;G01N21;G01N33/68;G01N33/574;G01N33/543;G01N21/76
申请人地址：	261023 山东省潍坊市经济开发区月河路699号
主权项：	1.一种血管内皮生长因子检测试剂盒，其特征在于：所述检测试剂盒包括包被有VEGF抗体的磁性微球混悬液、VEGF参考品、VEGF质控品、VEGF标记物、浓缩洗涤液和发光底物液；其中所述VEGF标记物通过吖啶酯修饰物对改造的VEGF抗体进行标记。 2.根据权利要求1所述的一种血管内皮生长因子检测试剂盒，其特征在于：所述吖啶酯修饰物为吖啶酯DEMS-NHS,所述改造的VEGF抗体是指将VEGF抗体与双功能螯合剂反应制备而成。 3.根据权利要求1所述的一种血管内皮生长因子检测试剂盒，其特征在于：所述包被VEGF抗体的磁性微球混悬液的浓度按照1:50-1:100的比例配制；所述VEGF标记物的浓度按照其与标记物稀释液1:500-1:10000的比例稀释；所述VEGF参考品和所述VEGF质控品均由VEGF标准品与参考品稀释液配制而成，所述VEGF参考品的浓度范围为0-2500pg/mL；所述VEGF质控品的浓度为125pg/mL、1000pg/mL。 4.根据权利要求1所述的一种血管内皮生长因子检测试剂盒，其特征在于：所述包被VEGF抗体的磁性微球混悬液的浓度按照1:50的比例配制，所述VEGF标记物的浓度按照其与标记物稀释液1:2000的比例稀释。 5.根据权利要求1所述的一种血管内皮生长因子检测试剂盒，其特征在于：所述参考品稀释液为pH7.5的HEPES缓冲液，且每1L缓冲液中还含有18-22g酪蛋白钠盐、14-15gSDS、3.8-4g DTT和0.3-0.5mL的PC300。所述浓缩洗涤液按照每1LpH7.5的Tris-HCl缓冲液中含有7-10gNaCl、0.3-0.6ml吐温-80和6-8ml Proclin-300进行配制。 6.根据权利要求1所述的一种血管内皮生长因子检测试剂盒，其特征在于：所述发光底物液包括发光底物液A和发光底物液B,所述发光底物液A的pH为2.5-2.6，所述发光底物液A的成分为双氧水和硝酸；所述发光底物液B的pH为12.3-12.7，所述发光底物液B的成分为氢氧化钾和TritonX-100。 7.一种如权利要求1所述的一种血管内皮生长因子检测试剂盒的制备方法，其特征在于所述制备方法包括以下步骤： (1)制备VEGF磁性微球混悬液取磁珠母液，加入磁珠包被缓冲液I混匀，吸取液体后再加入磁珠包被缓冲液I混匀，加入VEGF抗体混匀后再加入磁珠包被缓冲液II，混匀经过一段时间的反应，反应结束后吸取液体，再加入磁珠包被缓冲液III混匀，反应结束后吸取液体，再加入磁珠保存液混匀，再加入磁珠包被缓冲液IV，混匀后得到VEGF磁性微球混悬液； (2)制备VEGF参考品及质控品用参考品稀释液将VEGF标准品按一定的比例稀释成系列参考品，其参考品浓度范围为0pg/mL-2500pg/mL；按照上述操作制备浓度为125pg/mL、1000pg/mL的质控品，分装、冻干； (3)VEGF标记物的制备 ①溶液配制用0.1M，pH7.5的N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸溶液作为缓冲体系，配制浓度为1mg/mLVEGF抗体工作液； ②蛋白交联反应取2ml，1mg/mLVEGF抗体溶液，加入300μL，体积浓度为25％戊二醛，经过反应得到蛋白复合物VEGF-GA,再将该蛋白复合物置于HBS缓冲液中透析8h，备用； ③吖啶酯标记取0.1mg/mL的吖啶酯DMAE-NHS溶液，按照体积比1:1的比例加入1mg/mL透析后的VEGF-GA溶液，搅拌混匀经过反应得到的VEGF-GA-DMAE反应标记物经过透析，备用； ④VEGF-GA-DMAE标记物配置将透析后的VEGF-GA-DMAE反应标记物与标记物稀释液按照体积比1：1000-5000的比例进行配置； (4)配制浓缩洗涤液按照每1L、0.1M HEPES缓冲体系中含有7-10g NaCl、0.5-2g KCl、0.3-0.6ml TritonX-100、6-8ml Proclin-300和0.5-1g NaN3进行配置； (5)配制发光底物液A和发光底物液B 发光底物液A：取10-20L纯水，再加入200-278.4mlHNO3，100-132.8mlH2O2，纯水定容至30-40L，调pH到2.55±0.5；发光底物液B：取10-20L纯水，再加入300-400g KOH和600-800ml TritonX-100，纯水定容至30-40L，调pH到12.50±0.2； (6)将上述步骤(1)-(5)制备的磁性微球混悬液、VEGF标记物、参考品、质控品、浓缩洗涤液、发光底物液A和发光底物液B分别进行分装。 8.根据权利要求7所述的一种血管内皮生长因子检测试剂盒的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述包被缓冲液I的pH为7.0±0.1，每1L包被缓冲液I中含有0.97gTris、6.59gTris-HCI、9.00gNaCl；所述包被缓冲液II的pH为9.5±0.1，每1L包被缓冲液II中含有9.54g硼砂和6.18g硼酸；所述包被缓冲液III由BS31mg和TRIS缓冲液配置100μL，所述磁珠保存液的pH为7.4±0.1，每1L磁珠保存液中含有0.97gTris、6.59gTris-HCI和9.00gNaCl；所述包被缓冲液IV的pH为9.5±0.1，每1L包被缓冲液IV中含有14.5gNa2HPO4.12H20、1.48gNaH2PO4.2H20、0.50gPC300、5.00gBSA和0.50g吐温-20。 9.根据权利要求7所述的一种血管内皮生长因子检测试剂盒的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中标记物稀释液为pH7.5的PBS缓冲液，且每1LPBS缓冲液中还含有5-6g氯化钙、0.02-0.04％v/v的Proclin-300和0.3～1.0％v/v的AES。
所属类别：	发明专利