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原文传递一种用于Ⅰ型糖尿病联合抗体检测试剂盒及其制备方法

专利名称：	一种用于Ⅰ型糖尿病联合抗体检测试剂盒及其制备方法
摘要：	本发明公开了一种用于Ⅰ型糖尿病联合抗体检测试剂盒及其制备方法，试剂盒，包括：融合蛋白‑抗原‑抗体复合物，缓冲液，荧光素酶底物，标准品；抗体包括：GAD65抗体，IA‑2a抗体，IA‑2b抗体，IAA抗体，GADA抗体和ICA‑512抗体；制备方法通过将荧光素酶基因与抗原基因融合成融合载体，再利用细胞转化得到荧光素酶—抗原融合蛋白；再通过裂解基因重组细胞，纯化，捕捉获得融合蛋白‑抗原‑抗体复合物；再加入荧光素酶底物，检测荧光强度；本发明通过联合检测提高Ⅰ型糖尿病的检测的特异性和灵敏度，减少了检查次数，减少了漏判率。
专利类型：	发明专利
申请人：	杭州北角医学检验所有限公司
发明人：	唐东起;魏瑾;周扬
专利状态：	有效
申请日期：	1900-01-20T08:00:00+0805
发布日期：	1900-01-20T19:00:00+0805
申请号：	CN202010018193.9
公开号：	CN111175518A
代理机构：	杭州裕阳联合专利代理有限公司
代理人：	金方玮
分类号：	G01N33/68;C12N15/85;C12N15/65;G;C;G01;C12;G01N;C12N;G01N33;C12N15;G01N33/68;C12N15/85;C12N15/65
申请人地址：	311100 浙江省杭州市余杭区文一西路1500号未来科技城3号楼9层
主权项：	1.一种用于Ⅰ型糖尿病联合抗体检测试剂盒，其特征在于，包括：融合蛋白-抗原-抗体复合物，缓冲液，荧光素酶底物，标准品；所述抗体包括：GAD65抗体，IA-2a抗体，IA-2b抗体，IAA抗体，GADA抗体和ICA-512抗体。 2.根据权利要求1所述的一种用于Ⅰ型糖尿病联合抗体检测试剂盒，其特征在于，所述融合蛋白-抗原-抗体复合物通过将荧光素酶基因与抗原基因融合成融合载体，然后利用细胞转化技术，将融合载体导入哺乳细胞系统中，进行荧光素酶—抗原融合蛋白的表达；裂解基因重组细胞，获得荧光素酶-抗原融合蛋白；然后利用免疫沉淀反应，将荧光素酶-抗原融合蛋白稀释液与样本血清混合进行特异性结合，获得融合蛋白-抗原-抗体复合物；多抗原基因的目的序列包括：GAD-65抗原基因序列，IA-2a抗原基因序列，IA-2b抗原基因序列，IAA抗原基因序列，GADA抗原基因序列，ICA-512抗原基因序列。 3.根据权利要求1所述的一种用于Ⅰ型糖尿病联合抗体检测试剂盒，其特征在于，所述缓冲液包括：磷酸盐吐温缓冲液，磷酸盐缓冲液，荧光素酶底物检测缓冲液。 4.一种用于Ⅰ型糖尿病联合抗体检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一，构建荧光素酶基因与抗原基因的融合载体，选取荧光素酶基因和多抗原基因的目的序列，进行PCR扩增，在kpnl位点-GGTACC引入限制性内切酶，获得目的片段，做凝胶电泳进行鉴定；所述多抗原基因的目的序列包括：GAD-65抗原基因序列，IA-2a抗原基因序列，IA-2b抗原基因序列，IAA抗原基因序列，GADA抗原基因序列，ICA-512抗原基因序列；将获得的目的片段与载体质粒分别进行kpnl和xbal双酶切，并使用T4连接酶将目的基因与载体基因连接得到重组质粒；步骤二，质粒转化与扩繁提取，将重组质粒转化到感受态大肠杆菌中，进行大肠杆菌菌种扩繁，再使用质粒大提试剂盒提取重组质粒；步骤三，获取融合蛋白，通过细胞转化将融合载体导入哺乳细胞系统中，进行荧光素酶—抗原融合蛋白的表达，裂解基因重组细胞，收集细胞，获得荧光素酶-抗原融合蛋白；步骤四，纯化重组融合蛋白，利用免疫沉淀反应，将荧光素酶-抗原融合蛋白稀释液与样本血清混合进行特异性结合，获得融合蛋白-抗原-抗体复合物；步骤五，使用蛋白A/G琼脂糖酶标板捕捉融合蛋白-抗原-抗体复合物，步骤六，抗原抗体免疫反应，反应体系包括：融合蛋白-抗原-抗体复合物，PBS缓冲液，PBST缓冲液，荧光素酶底物，标准品，检测样品血清。 5.根据权利要求4所述的一种用于Ⅰ型糖尿病联合抗体检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述载体质粒为PA0815载体质粒。 6.根据权利要求4所述的一种用于Ⅰ型糖尿病联合抗体检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述荧光素酶基因为Ranilla荧光素酶基因。 7.根据权利要求4所述的一种用于Ⅰ型糖尿病联合抗体检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述感受态大肠杆菌的菌种为基因工程转化的含GAD65的重组大肠杆菌。 8.根据权利要求4所述的一种用于Ⅰ型糖尿病联合抗体检测试剂盒的制备方法，其特征在于，通过细胞转化将融合载体导入哺乳细胞系统中的步骤包括： 1)将T293细胞经过扩增培养40-60h，和细胞传代培养40-60h； 2)使用重组质粒进行磷酸钙转染，继续培养约48h后，使用PBS缓冲液收集细胞。
所属类别：	发明专利